在厕所与实验室间疯狂试探：硬核解析粪便菌株养成记

笑看风云

导读

粪便蕴含着丰富多样的肠道微生物群，从中分离出新的细菌菌株对研究人类健康、微生物生态具有重要意义。与直接用宏基因组测序相比，培养分离活的菌株可以让我们在菌株水平深入研究微生物功能和与宿主的互作。
本文将以科研专业科普的形式，详细介绍如何从粪便样本中一步步分离出新的肠道菌株，包括样本处理、培养基选择、培养条件控制、菌落纯化、16S rRNA鉴定以及菌株保存等环节。





从粪便样本中分离鉴定肠道菌株的流程示意图

上排依次为：新鲜粪便采集 → 在缓冲液中匀浆、梯度稀释 → 将稀释液涂布于培养基平板并37℃培养过夜 → 挑取不同形态单菌落 → 进行菌落PCR扩增16S rRNA基因 → 电泳检测PCR产物。下排为后续鉴定步骤：纯化PCR产物并进行测序 → 利用数据库比对鉴定菌株（如16S序列比对） → （可选）全基因组测序与基因注释 → 分析菌株的功能特性等。
本文主要关注上排培养分离及16S鉴定、保存等常规步骤。

一、样本处理

1. 粪便采集与保存：

尽可能采集新鲜的粪便样本进行分离，这是成功的基础。研究表明，新鲜粪便应立即处理，不宜长时间储存。如果无法立刻培养，可将样本置于4℃短期保存并在数小时内送检，但不建议超过12小时以上，以免厌氧菌死亡和菌群组成改变。如条件允许，可使用无氧取样装置或在厌氧环境中采样，以最大程度保持严格厌氧菌的活性。采集时使用无菌采样器具（如灭菌取样勺、试管），并配戴手套和口罩等防护装备，避免样本污染和人员暴露。典型一次所需粪便量不大，例如小型实验动物粪便30–100 mg左右即可成功分离目标菌；人粪便样本则通常取豌豆大小的一块即可满足大部分培养需求。



图中展示了用于采集粪便样本的无菌取样容器（前景为红色盖的粪便培养管，后方白色盖的是带勺的取样杯）。采集时，受试者将新鲜粪便置于取样杯中，再转移到培养管，尽量避免污染和保持样本原始状态，便于后续微生物检测分析。

2. 匀浆与梯度稀释：

将适量粪便置于无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）中制成粪便匀浆。常用比例是每1克粪便加入9–10 mL无菌PBS；样本量小时也可按每50 mg粪便加约1 mL PBS的比例。在超净工作台内用一次性无菌棉签或灭菌玻璃棒充分混匀粪便悬液，使之成为均质的菌液。随后进行十倍梯度稀释：取上述匀浆液0.1 mL加入0.9 mL PBS中制成10−1稀释液，再按同样方法连续稀释至10−2、10−3…依次类推。梯度稀释有助于将菌量降至合适范围，从而在平板上获得分散的单菌落。对于细菌浓度极高的粪便（如大肠杆菌丰度高时），稀释可进行到10−6甚至10−7；相反，对于目标菌含量可能很低的情况，可适当减少稀释级数以保留更多菌体。需要注意的是，在整个匀浆和稀释过程中应保持操作快速且尽量避免样液暴露在空气中过久，尤其是针对厌氧菌的分离，以减少氧气对其存活的不利影响。


（为了从粪便中分离单个菌株，常对粪便悬液进行梯度稀释，然后涂布于培养皿。上图演示了10 倍梯度稀释的效果：左侧未稀释平板上菌落过多，无法计数；中间稀释 10 倍后菌落适中且可计数；右侧再稀释 10 倍（即总体稀释100倍）后仅有零星菌落。通过梯度稀释，可以在某一稀释度下获得分离的单菌落，用于纯化培养。）
3. 接种涂布：

将不同梯度的稀释粪便悬液接种到预先准备好的培养基平板上。常用的方法是涂布平板法：用无菌L型涂布棒蘸取100 µL稀释液，在琼脂平板表面均匀涂开。也可以使用无菌棉签蘸取样液涂布，或采用划线法（如果样本浓度适中）。为了获得分离的单菌落，通常高浓度(低稀释倍数)和低浓度(高稀释倍数)的稀释液都分别接种一张平板——高浓度涂布可以保证检出低丰度菌种，而高稀释的涂布则有助于单个菌落的分离。接种时每张平板只涂布一种梯度，以便分开计数和挑选菌落。所有操作尽量在无菌条件下完成，涂布完毕后将平板培菌皿倒置（琼脂面朝下）放入培养箱中，避免冷凝水滴落影响菌落生长。


（实验人员使用无菌接种工具（如接种环或移液管尖）将稀释后的粪便悬液接种并划线于培养皿表面，以分离单个细菌菌落。图中正在含有培养基的平板上划线分离菌落，专注观察接种过程。培养皿中的培养基为细菌提供营养，通过划线逐步稀释菌液，在平板表面形成离散生长的菌落。经过适当孵育后，每个菌落源自单个细胞增殖，可用于后续纯化。）

二、培养基的选择和配制

1. 非选择性培养基

首先采用非选择性培养基（又称宽松培养基）培养，可让粪便中尽可能多种类的细菌生长。常用的非选择性培养基包括营养琼脂（NA）、Luria-Bertani培养基（LB）和血琼脂（Blood Agar）等。这类培养基提供丰富的营养，不含针对特定菌的抑制剂。例如，血琼脂加入5%绵羊血，可支持要求较高的细菌生长，并通过溶血现象鉴别菌种。又如改良的YCFA琼脂（酵母提取物–胰酪胨–脂肪酸培养基）在肠道菌分离研究中广泛使用，它富含氨基酸、维生素和脂肪酸等，可培育肠道大部分专性厌氧菌。在初筛阶段，同时平行接种多种培养基是明智的策略，以覆盖不同营养偏好的微生物。
2. 选择性培养基

为了靶向分离特定类别的细菌，可使用选择性培养基。选择性培养基中添加了抑制非目标菌的成分，或通过指示剂显色便于鉴别。举例来说，麦康凯琼脂（MacConkey agar）是经典的选择性鉴别培养基，设计用于选择性分离革兰阴性肠道杆菌，并通过乳糖发酵指示剂区分不同菌落。其成分中胆盐和结晶紫可抑制革兰阳性菌生长，而中性红指示剂在酸性环境（乳糖发酵产酸）变红色，使乳糖发酵菌落呈现红粉色、不发酵乳糖者则无色透明。例如大肠杆菌在MacConkey琼脂上由于发酵乳糖，会形成红色菌落且伴随培养基出现粉红色晕圈，而沙门氏菌、志贺菌因不发酵乳糖则形成无色菌落。又如MRS培养基（de Man, Rogosa and Sharpe培养基）常用于选择性分离乳酸菌，它含有高浓度葡萄糖和乙酸，以促进乳酸杆菌、生双歧杆菌等生长并抑制杂菌。在需氧条件下MRS主要长乳酸杆菌，厌氧条件下则有利于双歧杆菌、厌氧链球菌等。再比如胆汁葡萄糖血平板或胆汁七叶苷琼脂等添加了氧化胆盐，能够选择性富集耐胆汁的肠道厌氧菌（如拟杆菌属）。选择性培养基的使用可以根据研究目标进行组合搭配，如同时使用MacConkey、MRS、产气梭菌培养基等，从而有针对性地筛选出不同类群的新菌株。


（将人婴儿粪便样本在MRS厌氧培养基上涂布并在厌氧条件下培养所得的菌落（取自相关研究）。该培养基选择性培养肠道乳酸菌，使平板上长出了密集的浅褐色菌落（每个小点代表一个菌落）。由于粪便中乳酸菌大量增殖，菌落形成了“草坪”状的弥散生长。有些菌落产生细菌素（抑菌物质），从而在周围出现了小的透明抑制圈（箭头指示处），显示出这些菌株对邻近细菌的拮抗作用。该图直观体现了粪便菌群在选择性培养基上的生长特征以及菌间相互作用。）


（不同细菌在不同培养基上呈现不同形态。图中为沙门氏菌在选择性培养基XLD琼脂上的培养结果：琼脂底色为粉红色，沙门氏菌菌落呈现黑色中心（产生硫化氢使指示剂变黑）且周围略带透明晕圈，而不产硫的菌落则呈现黄色或透明。通过使用这种选择性和鉴别培养基，可以根据菌落颜色和特征初步区分目标菌（如沙门氏菌）与肠道中的其他菌群。）
3. 培养基的预处理

针对厌氧菌分离，培养基在使用前应进行预还原处理。具体做法是将琼脂平板置于厌氧环境中（如厌氧罐或厌氧培养箱内）静置过夜，使培养基中的残余氧被化学还原剂（如硫乙醇酸盐、L-半胱氨酸等）清除，从而创造有利于厌氧菌的低氧环境。对于需氧菌培养，则需确保培养基新鲜并充分通气。某些特殊微生物可能需要在培养基中添加特定底物或生长因子，例如分离产甲烷菌可能需添加甲酸盐或氢气源，分离粪肠球菌可在培养基中加入葡聚糖或特定抗生素进行选择性富集等。总之，培养基的选择和优化应结合目标菌特点，并可根据需要参考文献开发特殊培养基配方，以提高新菌株分离的成功概率。

三、培养条件

肠道菌群中既包含需氧或兼性厌氧菌（如大肠杆菌、肠球菌），也包含大量专性厌氧菌（如拟杆菌、厌氧梭菌、双歧杆菌等）。因此，在分离培养时需要分别设置好氧和厌氧两套条件，以覆盖不同类型的细菌。具体要点如下：
• 温度：

人体肠道菌最佳生长温度多为37℃（接近人体核心温度）。因此一般培养温度设定为37℃恒温培养约24–48小时。但也有少数肠道细菌喜好略低温度（30℃左右）或更高温度（40℃以上），可根据需要调整。为了提高多样性，也可以尝试平行设置不同温度的培养（如37℃和42℃）来分离嗜温/嗜热菌株。
• 好氧培养：

将接种后的平板置于常规培养箱中培养即可。需氧和兼性菌在有氧条件下生长良好。为促进兼性厌氧菌（如乳酸杆菌）的生长，可在培养箱中增加5%-10%的CO₂环境（使用CO₂培养箱），因为一些肠道菌为微需氧/需CO₂菌，在CO₂辅助下生长更佳。
• 厌氧培养：

对于厌氧平板，则需要在无氧环境中培养。常用的方法有：


（某些肠道菌为厌氧菌，需要无氧环境培养。图中示范了利用密封罐和蜡烛创造厌氧环境的简易方法：在带培养皿的密闭玻璃罐中点燃蜡烛，蜡烛燃烧消耗氧气并产生二氧化碳，当蜡烛熄灭时罐内形成低氧高二氧化碳的环境，适合厌氧微生物生长。培养期间需确保容器密闭以维持厌氧条件。现代实验室也常用厌氧培养袋或厌氧手套箱来培养厌氧菌。）
使用厌氧罐（Anaerobic jar）
将平板放入厌氧罐，添加化学产气包（通常是碳包和催化剂，释放H₂并与O₂反应生成水）以及厌氧指示剂。密封罐子后，产气包会在数小时内吸收氧气并产生厌氧环境，可维持厌氧状态直至培养完成。
使用厌氧培养袋
类似原理的小型一次性袋装系统，方便快捷，但容量有限。
厌氧手套箱
若实验室具备厌氧工作站或手套箱，可在其中完成接种和培养全过程。这种方法可确保全过程始终处于严格无氧状态，是分离挑剔厌氧菌（如产甲烷古菌或某些梭菌）的理想选择。
在厌氧条件下培养时，通常需延长培养时间。许多厌氧菌生长较慢，24小时可能仅形成极小菌落，建议培养48–72小时甚至更长，同时注意不宜频繁打开厌氧罐，以免破坏无氧环境。Monteon等的研究观察到，在血琼脂上接种虫粪便样本时，培养得到的菌落中有部分即使多次分离纯化仍混杂其他菌，表明厌氧菌纯化可能需要更耐心的重复操作。
• 其他条件：

一些特殊肠道菌可能对pH较敏感，例如双歧杆菌偏好弱酸环境，培养基初始pH可调至6.5–7.0；而大多数肠杆菌科更适宜中性略偏碱(pH 7.2–7.4)。培养环境湿度也需适当保持，以防琼脂干裂。在需氧培养时，可通过在培养箱内放置水盘保持湿度；厌氧罐通常自身就有一定湿度。
总之，并行设置多种培养条件是提高粪便菌株分离覆盖度的关键措施。例如，可同时进行 37℃好氧24小时培养、37℃厌氧48小时培养、以及强化CO₂条件培养等。这样能够兼顾肠道微生物的多样性，确保既能分离出好氧的普通菌株，也不遗漏那些难培养的厌氧新菌。

四、菌落观察与纯化

经过适当时间培养后，我们将在平板上看到不同菌落长出。此时需对菌落进行观察记录，并开始纯化分离工作：
1. 菌落形态观察

首先肉眼观察各平板上的菌落数量和形态。不同细菌的菌落在大小、颜色、形状、质地上可能存在差异。例如，大肠杆菌菌落一般中等大小、灰白色湿润；酵母样真菌则形成更大的奶油状菌落；产色菌如产赤色素的粘质沙雷菌菌落呈红色等。在选择性培养基上，不同菌落的指示剂反应也提供线索，比如MacConkey琼脂上粉红色的菌落通常是乳糖发酵阳性菌（可能是大肠杆菌或肠杆菌科），无色菌落则可能是沙门氏菌、志贺菌等。
记录每张平板上不同类型菌落的数量、形态特征和分布情况，为后续挑取提供依据。若某些平板上菌落过于稠密或融合，可优先关注高稀释度平板以找到分散的单菌落。


（图中平板上的橘红色凸起小点即为从粪便样品中分离得到的单一菌株菌落（示例：沙雷氏菌 Serratia marcescens 的菌落）。这些菌落质地湿润、有光泽，呈圆形，具有该菌特有的橘红色素。通过肉眼观察菌落的颜色、形态（如大小、边缘形状、表面光滑度和透明度），可初步判断菌株特性。菌落形态是鉴定菌种的重要依据之一。）
2. 挑取单菌落

利用无菌接种环或牙签，从平板上挑取代表性单菌落进行纯化。挑取时应选择边缘清晰、不与其他菌落相连的菌落，以确保其纯度。对于每一种不同形态的菌落都应至少挑1株，尤其是那些少见或独特形态的菌落，更值得关注（可能代表稀有或新奇菌株）。挑取后将菌落接种到新的平板上，通常可划线接种在对应的培养基上，以分离出更纯净的菌落。如果初代平板是选择性培养基，纯化时可以先转种到非选择性培养基（如血琼脂）上培养，以评估其纯培养特性，然后再转回选择性平板确认表型。如之前的研究所示，有时从粪便获得的混杂菌落需要多次反复分离才能得到纯种——要有耐心，多次划线直至菌落形态均一一致。
3. 显微镜初筛

为确保纯化成功，可取纯化后的菌落做革兰染色和显微镜检查。纯培养的菌落在镜下应呈现统一的形态（如都为革兰阴性杆状，大小一致），若发现有不同形态细胞混杂，说明仍未纯净，需要继续分离。显微镜检查还能帮助初步鉴定菌株类型，例如观察到芽孢、鞭毛、菌丝体等结构可提供线索。除此之外，也可以进行初步的生化试验（如氧化酶、触酶测试）对菌株性质有所了解，以便在挑选潜在“新菌株”时做参考。
4. 建立纯培养库

将成功纯化的各菌株分别编号登记，划线接种于新的斜面或平板，培养生长后用于后续鉴定和保存。此时获得的每个培养物理论上是单一菌株的纯培养。在继续鉴定之前，可以在适当培养基上培养产量，以便提取DNA和制备甘油菌种保藏管等。需注意在纯化过程中要严格避免交叉污染：每处理一个菌株要更换接种环，操作台及时消毒。同时，做好详细的记录，包括菌株来源样本、培养基种类、培养条件、菌落特征、显微镜结果等，为新菌株的后续研究建立完整的信息档案。

五、16S rRNA基因鉴定

获得纯培养后，需要鉴定菌株的种属归属。在科研实验中，16S rRNA基因序列分析是鉴定细菌的一项经典而可靠的方法。具体步骤如下：
1. 提取菌株DNA：

从纯培养的菌株中提取基因组DNA。对于刚分离的菌株，常用的方法之一是直接菌落PCR：即无需完整提取DNA，而是挑取少量菌落加入PCR反应体系，通过高温裂解细胞直接扩增其16S基因。也可以使用小型DNA提取试剂盒，或经典的煮沸裂解法（菌体在碱性缓冲液中加热释放DNA）。提取时要注意避免杂菌污染，使用纯培养的新鲜菌落进行。
2. PCR扩增16S基因：

准备16S rRNA基因PCR扩增的反应混合液，其中包括通用引物、DNA聚合酶、dNTP等。常用的通用引物是一对针对细菌16S基因保守区的引物，例如27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) 和 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)，这对引物几乎可扩增所有细菌的16S基因，全长约1500 bp。将引物、模板DNA和PCR Master Mix混合后，放入PCR仪按程序扩增。一个典型的16S PCR程序可能是：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55~60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，每一步循环30次；最后72℃延伸5分钟。对于直接菌落PCR，需要在反应混合液中加入细量的菌体并充分混匀。扩增完成后，将PCR产物暂存于4℃待检测。



用于PCR的热循环仪

3. 电泳检测PCR产物：

配制1%琼脂糖凝胶（将0.4 g琼脂糖溶于40 mL 1×TAE缓冲液，加热溶解后加入核酸染料如SYBR Safe或溴化乙锭），凝固后将PCR产物加上上样缓冲液，连同适当大小标记的DNA分子量标准（如1 kb DNA Ladder）一起加样到凝胶泳道中。以100V左右的电压电泳约30分钟，使DNA片段分离。电泳完毕后在紫外或蓝光透射仪下观察条带：理想情况下，每个样品应出现一条清晰的约1500 bp大小的条带，代表16S rRNA基因扩增子。


（使用通用引物扩增细菌16S rRNA基因后的琼脂糖凝胶电泳结果示例。
左侧(A)为电泳凝胶影像，梯度标记 (Lad) 为DNA Marker，可以看到对照的梯形条带。样品泳道中在约1500 bp位置出现明亮的扩增条带，表明成功扩增出16S基因片段（此示例图中不同泳道对应PCR循环数不同，但都产生了~1500 bp条带）。每条亮带代表一个菌株的16S扩增产物，大小与预期相符。(B) 图中右侧的彩色条形图属于原文其它分析内容，这里可忽略。
总之，通过凝胶电泳，科研人员可以直观确认16S PCR是否成功，为后续测序鉴定做准备。）


（PCR扩增完成后，常用琼脂糖凝胶电泳来验证产物大小和产量。图中粉红色凝胶在紫外透射仪下显示出亮红色的条带，每一条亮带对应DNA片段在电场中迁移的结果。左侧纵向的多条亮带是DNA梯形标准，用于估算样品片段长度；右侧数个孔道中可以看到目标PCR产物的条带，位置和亮度符合预期，表明扩增成功。通过电泳图确认产物无误后，可将16S扩增产物送测序以获得序列信息。）
4. 序列测定与比对鉴定：

将PCR扩增得到的16S rRNA基因产物送去测序。常用Sanger测序即可读取该~1500 bp的序列。得到序列后，利用在线数据库进行序列相似性比对（例如NCBI的BLAST，比对16S序列数据库；或Silva、RDP数据库等）。通常以序列相似度来判断菌株归属：若与某已知种的16S序列相似度高于97%，则大概率属于该已知种或其近缘种；若相似度低于95%甚至更低，则可能属于一个新的属甚至新科的微生物，有潜在新种价值。16S鉴定在科级以上分辨率高，但对近缘种区分有限，因此若发现介于95%–97%相似度的未知序列，需要进一步结合其他基因（如全基因组测序、或其它保守基因序列分析）来确立是否为全新物种。不过，在常规实验室中，16S测序足以确认分离菌株的大致分类地位，为后续研究提供指导。例如，通过16S测序你可以确认从粪便中分离出的菌株是否为常见的大肠埃希菌，抑或是罕见的梭菌属新成员等。


（上图是基于rRNA序列构建的生命树，展示了细菌（蓝色）、古菌（红色）和真核生物（三域）的系统发育关系。科研人员通过测定未知菌株的16S rRNA基因序列，并与数据库中已知序列进行比对，可定位该菌株在系统发生树上的位置，从而推断其分类地位和进化亲缘关系。例如，卡尔·沃斯（Carl Woese）正是通过16S序列比对揭示了古菌域的独立性。对临床或环境分离菌而言，16S序列分析是鉴定其属种的分子依据。）
5. 生理生化鉴定（可选）：

除了分子鉴定，传统的生化实验也可以帮助鉴定菌种。如根据革兰染色结果选择做氧化酶、发酵产酸产气试验、IMViC试验（用于鉴别肠杆菌科），或使用商用生化鉴定条（如API 20E等）获得生化反应谱，与数据库比对得到鉴定结论。在有条件时，还可尝试质谱鉴定（MALDI-TOF），通过飞行时间质谱检测菌体蛋白指纹图谱，与谱库比对鉴定。但需注意，对于潜在的新菌株，这些方法的数据库中往往没有对应信息，因此仍然要以16S测序等分子手段为准。综合分子和表型的结果，最终确定菌株的身份或确认其可能为未报道的新种。

六、菌株保存方法

成功分离鉴定出目标菌株后，需将其长期保存以供进一步研究。适当的保存可以确保菌株遗传性状稳定和活力持久。常用的菌株保存方法有：
1. 甘油冷冻保存

将菌株保存在含有甘油的培养基或保护液中，置于-80℃超低温冰箱（或液氮罐中）可长期保存。这是实验室中最常用的方法。
具体操作为：取菌株的新鲜培养物，加入无菌甘油和培养基（如Tryptic Soy Broth胰酪大豆肉汤）混合至终浓度15–20%甘油。分装于冻存管中，密封后迅速置于-80℃冰箱。甘油作为保护剂可防止细胞在冻结过程中形成冰晶受损。多数细菌在-80℃可保存多年而存活率保持良好。复苏时用无菌接种环刮取冷冻菌液接种到培养基上培养即可。为了保险，可以同一菌株制备多管冷冻保存液，以备不时之需。



图中所示为实验室使用的玻璃试管（带金属盖或塑料盖），可用于制备斜面培养基。纯化后的单一菌株可在斜面上培养，以保持活力和纯度。长久保存则常采用甘油冷冻法：将培养物与含保护剂（如20%甘油）的培养基混合后置于-80℃保存，备用时再复苏培养，可存储菌株多年。

2. 斜面低温保存

将菌株接种于斜面琼脂（如营养琼脂斜面、血琼脂斜面）培养生长后，密封试管保存于4℃冰箱。这种方法适合短期保存（数月），用于经常需要活化的菌株。为防止斜面干燥，可在菌斜面上覆盖无菌矿物油封存。定期（如每半年）传代更新斜面，以保持菌株活力。
3. 冷冻干燥（冻干）

将菌液与保护剂（如脱脂奶、PVP等）混合后进行真空冷冻干燥，可将菌株在室温下长期保存多年。冻干技术制备的菌株携带方便且稳定，但需要专门的冻干设备。很多菌种保藏中心会采用冻干形式保存模式菌株。实验室如有条件，也可尝试自行冻干重要菌株。
4. 其他方法

对于要求极高的菌株，也可考虑-196℃液氮保存，将菌株与保护剂混合后置于液氮中超低温保存（此法与-80℃保存相似，但温度更低理论上保存更久）。此外还有反复传代保种法（不推荐，易生变异）、甘油珠法等。不同菌株对保存方法的耐受性有所差异，必要时可以在保存一段时间后复苏培养，检查菌株活性和特性是否保持。
在进行菌株保存时，要做好标签和记录，注明菌株编号、名称、保存日期、保存方法等信息。保存管应妥善管理，防止反复冻融或污染。对于重要的新菌株，建议同时采用两种以上方法备份保存（例如既有-80℃甘油管，也有冻干管），以提高安全性。按照规范保存的菌株通常可以稳定保存多年甚至更久，为今后的深入研究奠定基础。

提高分离成功率的小技巧

1. 样本新鲜度：

尽量使用新鲜粪便进行培养分离，不让样本长时间暴露在空气中。新鲜样本能最大程度保持厌氧菌存活和菌群原始状态。如果样本需运输，可使用无氧运输培养基或密封低温运输，并尽快在12小时内开始培养。
2. 富集培养策略：

对于粪便中含量很低的目标菌，可先进行液体培养基的富集培养。例如将粪便悬液接种到富营养肉汤中厌氧培养数天，以增加目标菌相对丰度，然后再涂布分离。
文献报道，延长预培养时间并定期补加新鲜培养基，有助于分离出更多不同种类的细菌。不过富集也可能导致优势菌过度生长，需要权衡拿捏时间。
3. 多样培养条件：

正如前文提及，平行设置不同培养基和条件能显著提升分离到菌种的多样性。例如，可同时使用富血琼脂、MacConkey、MRS等数种培养基，在好氧和厌氧环境分别培养。对比不同条件下长出的菌落类型，往往会有惊喜发现——某些菌株也许可在一种条件下才能生长。
4. 选择性抑制策略：

如果目标是分离某类稀有菌，可以利用选择性因素抑制优势菌。例如粪便中大肠杆菌往往占比较高，可以在培养基中加入适量的抗生素（如针对肠杆菌的硝基呋喃类）来抑制其生长，从而给其他菌留下空间。又如为了分离芽孢梭菌，可先将粪便悬液80℃处理10分钟以杀死非芽孢菌，芽孢可存活下来再进行培养。此类预处理可根据目标菌特性设计。
5. 菌落挑选技巧：

在挑菌落时，不要只挑选长得最多的常见类型菌落，稀有的小菌落、颜色特别的菌落等都值得注意。经验丰富的研究者通过“经验性挑选”也能提高分离到新奇菌的概率。
研究显示，与其费力挑选所有菌落，不如凭经验挑各异样菌落更高效。因此培养者应培养观察敏锐度，尽量覆盖不同形态的菌落进行分离鉴定。
6. 优化培养基配方：

可以根据需要对培养基进行微调，如添加宿主消化的底物（纤维、多糖）来富集能分解该底物的菌；调整培养基pH或渗透压模拟肠道环境；加入关键营养因子（维生素K、血清、血红素等）以促生长难养菌。
Lagier等人在“培养组学”研究中提出添加羊血、瘤胃液等可显著增加可培养菌的多样性。因此大胆尝试不同配方组合，往往能意外分离出平常方法得不到的菌株。
7. 严格无菌操作：

分离过程的每一步都要注意无菌规范。这不仅防止外源杂菌污染干扰结果，也避免了目标菌的流失或竞争失败。使用洁净的超净台，定期用酒精和紫外灭菌；使用一次性无菌耗材；操作过程中勤洗手更换手套。良好的无菌技巧保障了分离结果的可靠性。
8. 重复与验证：

分离新菌并非一步到位。必要时可对同一样本多次重复分离过程，或在不同批次样本中验证分离方法的有效性。如果某次分离未得到满意结果，分析可能的瓶颈并调整条件后再次尝试。科研工作具有不确定性，坚持多尝试几轮，经常就能有所收获。

通过以上策略的综合运用，科研人员可以大大提高从粪便样本中分离到新菌株的几率。在实际工作中，灵活调整方案、积累经验非常重要。希望本指南所提供的分离流程和技巧能够为相关领域的研究人员和学生提供有益参考，助力发现更多未知的肠道微生物，为肠道菌群领域的科学研究贡献新的菌株资源和新知识。

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