ELISA的开发，需要知道的基础是什么？

笑看风云

免疫测定已经成为临床诊断和生命科学研究中最常见的方法之一。
酶联免疫吸附测定（ELISA）是使用最广泛的免疫测定配置，ELISA的缩写经常被用作所有类型的免疫测定的委婉说法。
根据严格的定义，它包括任何抗体或抗原包被的固相免疫测定，信号产生过程中有酶参与。
一些商业化开发的免疫测定系统已经不再使用酶来产生信号，但大多数免疫测定仍然是ELISA。
ELISA的原理非常合理。
由于一个分子的酶可以转化许多分子的底物，所以信号的产生被高度放大。
通常情况下，ELISA是使用microtiter®聚苯乙烯板进行的。
实验室规模的平板温浴器、清洗器和分光光度计提供了一个灵活而廉价的平台，可以将免疫测定的灵敏度和特异性应用于几乎无限的分析物。
内部开发的ELISA能够为筛选大量样品提供廉价、可靠的测试，这对无数研究人员和预算有限的临床生物化学家来说具有不可抗拒的吸引力。
从两个生物实体（抗体和酶）中哄骗出尽可能好的性能有时是很苛刻的，而且对不小心的人来说有陷阱。
但是这种努力的回报是能够快速和廉价地测试成千上万的样品，以检测微小浓度的分析物。
幸运的是，大量的抗体可以在市场上买到，常用的酶也有很好的特性，并在无数的情况下被证明是可靠的。
ELISA用于检测和定量抗原、抗体、激素和其他分子。
除了在临床诊断中的应用外，ELISA还被用作许多研究目的的专用测定，如表征新的蛋白质和开发新的药物疗法。
尽管许多体外诊断公司生产用于研究的试剂盒，但它们无法跟上研究人员在蛋白质组时代调查新蛋白质的不断扩大的需求。
一些制造商为研究人员提供定制服务，但具体的研究要求往往超出所提供的测定的能力。
许多面向研究的ELISA试剂盒很昂贵，而且不可靠。
因此，研究人员经常开发内部ELISA方法。
开发一种ELISA方法曾经是一项非常复杂的任务，需要多学科的知识和技能。
但在过去的十年中，尽管基本原则保持不变，但ELISA所涉及的技术有了很大的改进。
本章的目的是为研究人员提供一般指导，以开发他们自己的ELISA方法，根据他们的要求，重点是内部使用的检测设计的基本概念和最佳做法。
在本书的其他部分，对这里涉及的许多主题有更多的细节，但本章描述了一种实用的测定的开发。
基本的ELISA程序包括平板包被、封闭、洗涤、信号产生和测量。
酶联免疫吸附法通常在96孔板或8孔或12孔条中进行，这些板由聚苯乙烯制成，会被动地结合蛋白质。
在ELISA中，除非结合抗原以检测样品中的抗体，否则抗体通常会直接结合到聚苯乙烯上。
然后用惰性蛋白（如BSA）使每个孔的剩余未涂覆区域饱和，以防止试剂的任何非特异性结合。
接下来，将样品加入孔中并进行温浴，使分析物（样品中的抗原或抗体）与包被抗体结合。
正是试剂在微孔板表面的包被和随后的分析物的结合使ELISAs相对容易进行。
洗孔可以去除非特异性结合的物质，使ELISAs可以测量粗制的分析物。
最后，用特定的酶结合抗体对反应进行定量，该抗体与底物一起引起颜色反应的比例变化。
随着检测的进行，分析物被固定的抗体和酶结合的抗体夹在中间，这就是为什么ELISAs被俗称为夹心法测定的原因。
见图1。


为了设计和开发一种ELISA方法以满足分析性能的要求，研究人员应该熟悉开发过程的概念和阶段。
在实践中，开发内部使用的特定ELISA的阶段是：
►    开发；
►    优化；
►    验证。
在开发阶段，选择检测设计的关键因素，如抗原和抗体、免疫反应的试剂配方和信号产生系统（酶、抗体和测定）。
在优化阶段，对关键因素进行测试和滴定，以最大限度地提高性能，实现最佳的权衡，例如在便利性和分析能力之间。
最后，在验证阶段，该方法被验证为所需的性能。
开发一个ELISA方法的时间可能很短，也可能相当长，这取决于关键原料的可用性和质量以及其中遇到的技术挑战。
在一个组织良好的实验室，有合适的抗体可用，一个免疫测定专家有时可以在几天内开发出一个可接受的ELISA方法。
但通常，一个ELISA需要几个月甚至几年的时间来开发。


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