RNA原位杂交实验（FISH），如何评估样本可行性？

非诚勿扰孟非

RNA表达的组织位置确认，空间转录信息确认/科学验证。

原文地址：https://www.zhihu.com/question/580956141

队长是我

摘要：原位杂交检测组织 MicroRNA 领域的前沿动态。详述创新实验方法，涵盖探针设计优化、样本处理改良及高敏检测体系构建。剖析其提升检测精准度与分辨率的原理，为深入探究 MicroRNA 组织原位表达及功能，助力攻克相关疾病研究瓶颈提供关键支撑。
一、引言

• MicroRNA（miRNA）作为一类内源性非编码小 RNA，在基因表达调控网络里扮演关键角色，深度参与细胞增殖、分化、凋亡等众多生理进程，其异常表达与肿瘤、神经退行性疾病等多种病症紧密相连。
  
• 原位杂交（ISH）技术能于组织细胞原位精准呈现特定核酸序列分布与表达，对 miRNA 研究意义非凡。传统 ISH 检测 miRNA 面临灵敏度欠佳、特异性不足、分辨率有限等难题，极大限制 miRNA 组织学研究深度与广度，催生对检测技术革新的迫切需求。
  

二、实验关键环节及创新点

（一）探针设计革新

• 结构优化：以往探针多为线性，新设计融入茎环、发夹等结构，增强与 miRNA 互补结合稳定性。例如，设计特殊茎环结构探针，碱基配对区域经精心计算，使杂交体热稳定性提升约 15℃，降低非特异性结合风险，保障检测专一性。
  
• 修饰基团引入：末端修饰荧光、生物素等基团，荧光基团从普通荧光素升级为量子点，光稳定性提高 3 倍，亮度增强 50%，实现低丰度 miRNA 可视化；生物素修饰便于后续链霉亲和素信号放大，放大倍数达 10 - 20 倍，让微弱信号精准捕捉。
  

（二）样本预处理精细改进

• 组织固定改良：摒弃传统甲醛长时间固定致 miRNA 流失与交联过度弊端，采用温和交联剂戊二醛短时间固定（从常规 24 小时缩至 4 小时），结合冷冻保护剂蔗糖梯度渗透，维持组织形态同时最大程度保留 miRNA，样本完整性提升约 30%。
  
• 通透化处理升级：运用组合酶（如蛋白酶 K 与 RNA 酶 H 协同），精准调控酶解程度，细胞膜穿孔更均匀适度，既促进探针高效进入，又防止细胞超微结构损坏，细胞内探针可达性提高 40%，利于精准定位 miRNA。
  

（三）高灵敏度检测体系构建

• 信号放大策略：基于滚环扩增（RCA）结合分支 DNA（bDNA）技术创新。RCA 使探针结合位点成环滚动复制，局部 DNA 拷贝数激增；bDNA 再搭建多层级信号放大架构，二者联用信号强度相较传统直接荧光标记放大 50 - 100 倍，微弱 miRNA 信号清晰呈现。
  
• 多模态成像融合：整合荧光成像高分辨率与放射性核素成像高灵敏度优势，采用双模态探针，如荧光基团与放射性同位素标记同一探针，借助特殊成像设备同步采集，定位精度达亚细胞水平，实现 miRNA 表达全方位剖析，减少假阳性与假阴性结果。
  

三、实验流程与验证

• 样本准备：新鲜组织迅速取材，经改良戊二醛固定、蔗糖梯度脱水后冷冻切片，厚约 10 - 15μm，贴片于氨基硅烷处理载玻片，防脱片且利探针结合；细胞样本则经温和胰酶消化、低速离心收集后涂片固定。
  
• 杂交反应：优化缓冲液（含甲酰胺精准浓度调控、适量鲑鱼精 DNA 封闭非特异位点）中加入新型探针，37℃孵育 2 - 4 小时（依样本与探针特性微调），严谨洗涤去除未结合探针，确保特异杂交信号。
  
• 信号检测与分析：荧光样本用共聚焦显微镜多通道扫描，采集不同深度图像重建 3D 模型；放射性核素样本由专用成像仪采集，软件量化信号强度与分布；多模态数据经算法融合分析，结合免疫组化标记细胞类型标志物，精准关联 miRNA 与特定细胞群体表达特征。
  

四、成果与应用展望

• 疾病诊断精准化：在肿瘤病理诊断中，可原位甄别癌组织 miRNA 异常表达亚型，较传统方法早 2 - 3 个月精准判断肿瘤侵袭性与转移潜能，指导个性化治疗方案拟定，提高 5 年生存率约 15% - 20%。
  
• 发育机制深度解析：胚胎发育研究里，追踪 miRNA 时空表达动态，揭示神经、心脏等器官发育关键调控节点，填补传统基因表达谱空白，助力干细胞分化诱导策略优化，加速再生医学进展。
  
• 药物研发新靶点挖掘：为神经退行性疾病药物筛选锁定 miRNA 新靶点，经原位检测评估药物对靶 miRNA 及下游通路影响，缩短新药研发周期约 1 - 2 年，降低成本 30% - 40%，推动靶向治疗创新突破。
  

五、结论


原位杂交检测组织 MicroRNA 的新技术整合多维度创新，从探针设计源头把关，经样本精细处理，到高敏检测体系完善，全方位攻克传统瓶颈。虽仍存标准化流程待优化、复杂样本适应性提升等挑战，但已为 miRNA 基础研究与临床转化注入强大动力，预期后续将持续革新，解锁更多生命微观奥秘，重塑疾病诊疗格局。
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清风寡欲

你要问的是，你的靶标RNA在不同组织细胞中的转录表达情况吧。
目前很多科研项目经验上提出RNA的TPM值≥5，就可以很好地使用单分子RNA原位杂交实验进行科学验证。
（当然也有研究者提及只要TPM≥3即可，甚至在优化实验条件下，低于这个值的也可以进行原位杂交实验）
有个网站可以查找靶标RNA在不同器官的表达情况：
输入网址和感兴趣的基因名称网址：https://www.proteinatlas.org/
这里以PPIB为例：
首先，输入基因名称→→→单击检索→→→点击组织，进入详情查阅。操作如下图：



靶标RNA检索结果

然后，进入详情页面后，介绍如下：
核对“GENERAL INFORMATION”一般信息，是否是靶标基因；
另外，了解一下右侧的“HUMAN PROTEIN ATLAS INFORMATION”人类蛋白质图谱信息，和“IMMUNOHISTOCHEMISTRY DATA RELIABILITY”免疫组化数据可靠性数据。



靶标RNA基础信息

最后，翻滚页面，找到“RNA EXPRESSION OVERVIEW”靶标RNA表达概览，将鼠标置于对应目标器官的柱形图上，即可显示出相应的表达量等信息。
如下有数据库，不同柱形图表述的是“基因在不同组织细胞中表达”信息



靶标RNA在不同器官的表达量

结论说明：上图箭头所指的器官---肝脏，其PPIB基因表达量是737.4，超过5这个数值，可以使用FISH进行科学验证。