美国三种犬布鲁氏菌血清学检测的性能特征

John

犬布鲁氏菌是一种狗的人畜共患病原体，对诊断构成挑战。虽然通过 PCR 或培养直接检测犬双歧杆菌是理想的，但血清学诊断对于识别携带动物是必要的，并且可以支持布鲁氏菌病的临床诊断。在 2022 年之前，美国的犬双歧杆菌血清筛查主要使用市售的快速玻片凝集试验进行。然而，该试剂盒已于 2022 年初被制造商停产，在商业犬双歧杆菌血清测定的可用性方面留下了空白。本研究的目的是比较目前可用的三种犬布鲁氏菌血清学检测的性能：VMRD 绵布鲁氏菌 ELISA、Bionote Anigen 快速布鲁氏菌抗体免疫层析侧向层析测定和 VMRD 犬布鲁氏菌间接荧光抗体 （IFA） 测定。最初提交给康奈尔大学动物健康诊断中心（研究参考实验室）用于犬双歧杆菌血清筛查的 56 份库存血清标本被分发到 12 个检测实验室。每个样品都在参考实验室开发的三种测定法上运行：2-巯基乙醇 （2-ME RSAT） 的快速玻片凝集试验、使用细胞质抗原的琼脂凝胶免疫扩散试验 （AGID II） 和犬布鲁氏菌多重检测。5 个检测实验室运行 ELISA，6 个运行侧向层析，6 个运行 IFA。当作为筛选试验进行评估时，我们将这些试验与 2ME-RSAT 进行了比较。ELISA 的敏感性最高 （96.8， 95%CI 83.8–99.9），但特异性最低 （79.3， 95%CI 57.9–92.9）。侧向层析的敏感性为 90.6% （95% CI 75-98%），IFA 为 87.5% （95% CI 71-96.5）。侧向层析的特异性为 95.8% （95% CI 78.9–99.9），IFA 为 97.5% （95% CI 67.6–97.3）。与 AGID II 和犬布鲁氏菌多重检测相比，测试检测均具有高度敏感性，但特异性为 <90%。IFA 的评分者间信度最高 （Κ = 0.92），侧向层析的评分者信度最低 （Κ = 0.82）。当使用本研究中测试的三种检测中的任何一种时，仍然需要使用更特异性的检测（例如 AGID II）对阳性样本进行系列检测。
引言
犬布鲁氏菌是犬布鲁氏菌病的主要病原体，是一种人畜共患病原体，位于细胞内，可在巨噬细胞中持续数月至数年.感染的临床体征是非特异性的且高度可变的，范围从睾丸增大和流产到眼部异常和椎间盘炎.这种不一致的临床体征和生物体在细胞内慢性持续存在的结合使犬双歧杆菌成为一项诊断挑战.金标准诊断方法是通过培养直接检测犬双歧杆菌，尽管 PCR 的使用越来越多地被描述.然而，在受感染的动物中并不总是可以直接检测到，因为分泌物中的细菌脱落和菌血症可能是间歇性的和短暂的，循环中的微生物水平较低。
由于直接检测犬双歧杆菌的困难，血清学检测对于犬双歧杆菌筛查很重要，因为在菌血症减弱后，狗仍然呈血清阳性。不幸的是，犬双歧杆菌的血清学检测往往具有相对较低的敏感性和特异性.然而，它们仍然可用于检测可能无法通过其他方式识别的亚临床和慢性感染，以及筛查繁殖动物.在美国，通常推荐用于犬双歧杆菌诊断和筛查的血清学检测是快速玻片凝集试验 （RSAT）、2-巯基乙醇快速玻片凝集试验 （2ME-RSAT） 和使用细胞质抗原的琼脂凝胶免疫扩散试验 （AGID II）。市售的 RSAT（带有可选的 2ME 步骤）Zoetis D-Tec CB 已上市至 2022 年。目前在美国没有 RSAT、2ME-RSAT 或 AGID II 检测或检测成分的市售来源，因此可用于犬芽孢杆菌筛查和诊断的诊断检测存在空白。
本研究的目的是评估三种犬双歧杆菌血清学检测方法的性能，这些方法在美国研究时可供兽医诊断实验室使用或通过对一组 56 个临床血清标本进行实验室间比较作为即时检测。测试的检测是 VMRD 绵梭菌 ELISA、Bionote Anigen 快速布鲁氏菌抗体免疫层析侧向层析测定和 VMRD 犬布鲁氏菌间接荧光抗体测定 （IFA）。将这些检测与 2ME-RSAT、AGID II 和康奈尔大学动物健康诊断中心 （AHDC） 的犬布鲁氏菌多重检测 （CBM） 进行了比较。
材料和方法
实验室
参与的检测实验室是：科罗拉多州立大学兽医诊断实验室（科罗拉多州柯林斯堡）、印第安纳州动物疾病诊断实验室 - 普渡大学（印第安纳州西拉斐特）、蒙大拿州兽医诊断实验室（蒙大拿州博兹曼）、内布拉斯加州兽医诊断中心（内布拉斯加州林肯）、北达科他州立大学兽医诊断实验室（北达科他州法戈）、俄亥俄州立大学兽医中心临床微生物学实验室（俄亥俄州哥伦布市）， 宾夕法尼亚兽医实验室（宾夕法尼亚州哈里斯堡）、佛罗里达大学兽医医院临床微生物学实验室（佛罗里达州盖恩斯维尔）、弗吉尼亚理工大学动物实验室服务（弗吉尼亚州布莱克斯堡）、华盛顿动物疾病诊断实验室（华盛顿州普尔曼）、怀俄明州兽医实验室（怀俄明州拉勒米）。参考实验室是康奈尔大学 AHDC（纽约州伊萨卡），提供 2ME-RSAT、AGID II 和 CBM 测试结果。检测实验室自愿参与这项研究，并自行选择一两种诊断检测方法进行测试，这些检测方法被认为是每个相应实验室使用的候选检测方法。ELISA 在 5 个实验室进行了检测，IFA 在 6 个实验室进行了检测，侧向层析测定在 6 个实验室进行了检测。标本于 2023 年 9 月至 11 月进行了检测。所有实验室都建立了质量保证体系，工作人员在进行血清学检测方面经验丰富。
测试面板
测试小组的样本由康奈尔大学 AHDC 从库存的临床样本中提供，并分发给参与的实验室。诊断测试后，在康奈尔大学 AHDC 将血清样本在 -20°C 下冷冻，并根据足够体积的可用性和先前的犬芽孢杆菌血清学检测结果选择用于研究。测试组由 56 个样品组成，其中包括 24 个 2ME-RSAT 和 AGID II 阴性样品，7 个 2ME-RSAT 阳性和 AGID II 阴性样品，以及 25 个 2ME-RSAT 和 AGID II 阳性样品（20 个 CBM 高阳性，5 个 CBM 低阳性或模棱两可）。由于面板的大小和潜在测试结果的范围.
在将样本分装并运送到参与实验室之前，在 AGID II、2ME-RSAT 和 CBM 上对样本进行了检测。将血清运至参与实验室，在干冰上冷冻保存，并在每个实验室冷冻储存（-20°C 或更低），直至检测进行。标本于 2023 年 9 月至 11 月进行了检测。
稀释系列
稀释系列的标本是在弗吉尼亚理工大学动物实验室服务（弗吉尼亚州布莱克斯堡）制备的。合并两等分试样 NVSL 试剂 212-H“高阳性犬双歧杆菌管凝集试验 （TAT） 对照血清”（国家兽医服务实验室，爱荷华州艾姆斯），并使用无菌 0.9% 盐水作为稀释剂进行连续 2 倍稀释。生成的样本范围从纯、未稀释的对照血清到 1：2048 稀释液。制备等分试样并在 −20°C 下冷冻直至运输。标本在生成后 72 小时内在冰上运送到参与的实验室。将标本冷冻储存在每个实验室（-20°C 或更低）直至检测进行。稀释系列样品由相同的作员使用测试面板运行。
血清测定
康奈尔大学 AHDC 进行的分析包括 2ME-RSAT、AGID II 和 CBM。2ME-RSAT 使用康奈尔大学来源的犬双歧杆菌 M 菌株的灭活全细胞抗原进行，并用孟加拉玫瑰染色。如前所述，将患者血清与 0.2 M 2-巯基乙醇 （2-ME） 混合.AGID II 是使用犬双歧杆菌 M 菌株衍生的细胞质抗原进行的，并如前所述进行.使用基于多重荧光珠的平台 （Luminex） 进行 CBM，捕获试剂由重组犬双歧杆菌蛋白组成，包括 BP26 和源自 Omp31 的肽.
在检测实验室进行的检测包括绵支链球菌 ELISA 检测成分（VMRD，华盛顿州普尔曼）、犬支链球菌 IFA 检测（VMRD，华盛顿州普尔曼）和快速布鲁氏菌免疫层析侧流检测（Bionote Anigen，Gentaur，加利福尼亚州圣何塞）。11 个检测实验室对每个检测试剂盒一式两份进行检测，每次检测由不同的作员生成。一个测试实验室在单线蛋白中运行了他们的测试分析。
按照制造商试剂盒插入说明进行犬双歧杆菌 IFA 和 Bionote 侧向层析。对于 IFA，标本以 1：50 的筛选稀释度运行。简而言之，绵羊双歧杆菌 ELISA 的方案是在血清稀释缓冲液中以 1：50 的比例稀释样本，并将 100 μL 稀释的样本加载到抗原包被板中。将标本在室温下孵育 30 分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤板 4 次。加入过氧化物酶偶联物，然后再进行 30 分钟室温孵育和 4 次洗涤。最后，在室温下用过氧化物酶底物溶液显影 15 分钟，然后加入终止液。在 450 nm 处读取板，并将光密度值转换为 S/P 比。阳性的临界值为 S/p ≥ 0.8，这是基于制造商提供的犬类数据。
统计分析
每个实验室的结果由研究负责人 （TEL） 汇总。根据康奈尔大学 ADHC 检测确定每种检测的灵敏度和特异性：2ME-RSAT、AGID II 和 CBM。灵敏度和特异性计算基于每个实验室提交的每次检测的第一个结果。CBM 检测是半定量的，因此结果被重新分类为阴性（阴性结果）和阳性（模棱两可、低阳性和高阳性）类别，用于敏感性/特异性计算。根据二项式概率计算精确的 95% 置信区间。评分者间可靠性由 Cohen 的 kappa 确定。这些计算在 SAS（北卡罗来纳州卡里）中执行。根据灵敏度/特异性计算手动计算 Youden 指数。将 ELISA S/P 比值与 2ME-RSAT 结果进行比较，用于受试者作特征 （ROC） 分析。通过使用在线工具 easyROC （v.1.3.1） 最大化约登指数.
结果
血清面板
每种检测相对于参考犬芽孢杆菌血清测定 2ME-RSAT 和 AGID II 的灵敏度和特异性在表 1.IFA 测定的测试测定的评分者间可靠性最高，Κ = 0.92 （95%CI： 0.88–0.96）。其他测定的评分者间可靠性的 kappa 评分为：ELISA Κ = 0.87 （95%CI： 0.82–0.93），侧向层析 Κ = 0.82 （95% CI 0.79–0.86）。



表 1.研究中每种测试测定的敏感性和特异性，基于在每次测定中测试的 56 份血清样本的测试组。

我们根据研究中至少一项测试分析的结果，确定了面板上有多少样本的结果与所有三种参考实验室测试（2ME-RSAT、AGID II 和 CBM）不一致。当所有参考实验室检测均为非阴性时，侧向层析检测阴性的血清样本数量最高 （n = 6）。当所有参考检测均为阴性时，ELISA 检测呈阳性的样本数量最高 （n = 8）。
ELISA 临界值评估
根据 ROC 分析将 ELISA S/P 比值与参考 2ME-RSAT 结果进行比较，本研究中生成的数据的 ELISA 最佳临界值为 0.913。使用此临界值，ELISA 相对于 2ME-RSAT 的修订敏感性为 93.1% （95% CI： 89.8–95.6），修订后的特异性为 86.7% （95% CI： 81.7–90.7）。使用修订后的 S/P 临界值，当所有参考测试均为阴性时，ELISA 检测呈阳性的样品数量减少到 7 个样品。
连续稀释系列
通过测试国家兽医服务实验室（NVSL，艾姆斯，爱荷华州）提供的犬双歧杆菌 TAT 对照血清的系列稀释面板来评估每次测定的相对检测限 （表 2).



表 2.在每次测定中对 NVSL 试剂 212-H 犬布鲁氏菌高阳性 TAT 对照进行两倍连续稀释，以比较每次测定对标准化血清标本的检测限。

讨论
临床医生和兽医诊断实验室获得可靠的犬双歧杆菌诊断测试至关重要。由于犬双歧杆菌仍然是一个诊断挑战，没有一种诊断方法最适合每个病例，因此我们进行了这种实验室间比较，以提高对美国目前可用的犬双歧杆菌检测方案的优势和局限性的理解。由于为研究中使用的测试组提供血清的动物的培养物和 PCR 状态均不可用，因此无法确定灵敏度和特异性计算的真正“金标准”。因此，我们确定了康奈尔大学 AHDC 目前提供的每种检测的灵敏度和特异性，该实验室已成为美国犬双歧杆菌参考实验室，也是目前唯一一家提供 CBM、2ME-RSAT 和 AGID II 检测的实验室用于诊断检测。
迄今为止，Bionote B. canis 免疫层析侧向层析测定尚未得到很好的表征，尽管制造商在试剂盒说明书中报告说，与 2ME-RSAT 相比，该测定的“总体准确度大于或等于 90%”.抗原组成尚未得到很好的描述，但根据 Bionote 的母公司韩国 Animal Genetics， Inc. 之前发表的数据，可能是犬双歧杆菌 M （-） 菌株的全细胞提取物。尽管当前测试迭代缺乏经过验证的性能信息，但它被许多兽医用作停药 Zoetis D-tec RSAT 后犬双歧杆菌的即时筛查测定。在对检测性能进行内部评估后，一些兽医诊断实验室也开始提供这种侧向层析检测。该检测试剂盒在巴西以“Anigen 快速犬布鲁氏菌抗体检测”（由韩国 Bioeasy 生产）的名义进行评估。虽然该测试总体上比 RSAT、2ME-RSAT 和绵羊芽孢杆菌 AGID 具有更高的敏感性，但 10.4% 的受感染狗（通过培养和/或 PCR 确认）检测呈阴性.然而，在研究中检测呈阴性的 5 只受感染的狗中，有 3 只在检测呈阴性时出现活动性布鲁氏菌病的临床症状，并且可能尚未发生血清转化，因为它们的 RSAT 或绵羊芽孢杆菌 AGID 检测也没有呈阳性。在美国犬双歧杆菌患病率相对较低的人群中，例如许多繁殖犬舍，使用侧向层析测定可能足以作为筛选测定，但由于与确认性 AGID II 相比，该测定的特异性仍需要使用另一种方法进行后续检测以进行确认。
尽管 Youden 指数（衡量整体诊断测试性能的指标）最高，但侧向层析测定在本研究中测试的测定中评分者间可靠性最低。一些实验室报告说，由于检测试剂盒上出现的非特异性无色条带，难以读取侧向层析测定中某些标本的结果。虽然没有颜色变化，但这些区域的颜色与测试设备的背景颜色略有不同，因此可能会被误解为非阴性结果。这一点，以及侧向层析测定中颜色变化的定性评估，可能导致该测定的评分者间可靠性较低。尽管测试作员之间的一致性较低，但该检测的一致性仍然可以被解释为“几乎完美”.本研究中的所有测试作者都是兽医诊断实验室经验丰富的技术人员;由于该环境中测试作者的经验差异较大，诊所环境中的评分者间一致性可能会较低。由于犬双歧杆菌感染的人畜共患影响，谨慎的做法是将任何不明显为阴性的检测结果视为确认检测的指征。
本研究中使用的 ELISA 抗原是绵羊双歧杆菌全细胞脂多糖提取物，专为绵羊双歧杆菌检测而设计。ELISA 试剂目前仅供研究使用。与犬双歧杆菌一样，绵羊双歧杆菌也是一种粗糙的菌株，这两个物种具有血清学交叉反应性.制造商还对犬血清样品进行了 ELISA 成分测试，以测试犬双歧杆菌暴露情况。与 IFA 分析相比，制造商对 ELISA S/P 比值的 ROC 分析表明，0.8 的 S/P 截断值是理想的。我们使用 2ME-RSAT 作为参考测试的 ROC 分析表明，略高的 S/P 截断值 0.931 提高了 ELISA 的特异性，而不会大大降低敏感性。如果羊双歧杆菌 ELISA 用作筛查试验，则需要通过更特异性的试验（如 AGID II）进行随访检测。尽管 ELISA 结果由自动阅读器读取并使用标准临界值进行解释，从而提高了结果解释的客观性，但该检测并不具有本研究中观察到的最高评分者间可靠性。
IFA 检测使用犬双歧杆菌菌株 RM666 抗原，这是犬双歧杆菌的美国型菌株.我们使用了 1：50 的筛选稀释度，但制造商的验证数据显示 1：100 的稀释度可以减少假阳性反应.我们在这项研究中使用了 1：50 的样品稀释度，因为这是使用 IFA 进行诊断目的的任何实验室经常使用的最低稀释度。制造商试剂盒说明书表明，1：100 呈阳性的样本为“可疑”样本，建议使用 AGID II 等确认性检测进行后续检测.
大多数犬双歧杆菌血清学检测可检测抗脂多糖 （LPS） 抗体，这可能导致与革兰氏阴性菌抗体.此外，针对其他细菌表面抗原产生的抗体可导致非特异性犬双歧杆菌血清学检测结果.AGID II 检测可以通过使用细胞质抗原来避免非特异性反应，而 CBM 检测使用非 LPS 抗原来避免非特异性抗 LPS 抗体结合.因此，由于 AGID II 和 CBM 的抗原差异，与 AGID II 和 CBM 相比，三种测试测定的特异性为 <90% 也就不足为奇了。
高滴度犬双歧杆菌 TAT 对照血清 212-H 是作为试管凝集试验的对照生成的，因此其性能仅针对该测定进行了优化。该试剂是从自然感染的狗中获得的，由含有 0.02% 硫柳汞作为防腐剂的冻干血清组成。研究发现，参考检测 2ME-RSAT 和 AGID II 在用于不同检测系统的血清中检测抗体的能力较低，这凸显了犬芽孢杆菌血清诊断的困难。该血清样品中可能存在针对抗原靶标的抗体，这些抗体与 2ME-RSAT 和 AGID II 中的抗原相互作用最小。
在我们评估了三种具有不同检测形式和抗原的犬双歧杆菌血清学检测，每种检测在 5 或 6 个不同的兽医诊断实验室进行，我们发现所有检测的评分者间可靠性都很好。每种测试分析都有其自身的局限性，并且没有单一的分析具有最佳的整体性能。侧向流动的评分者间一致性最低。ELISA 的特异性最低，但可以通过优化阳性/阴性结果的 S/P 比值截断值来部分缓解这种情况。与 2ME-RSAT 相比，IFA 的敏感性最低，而 2ME-RSAT 在美国历来被用作主要的犬双歧杆菌筛查测定。在了解这些局限性的情况下，所有三种测试分析都可以合理地纳入犬双歧杆菌的诊断测试算法中，但对于所有测试，任何测试的阳性结果都表明需要使用更特异性的测试进行后续测试.
文献原文地址：
https://www.frontiersin.org/journals/veterinary-science/articles/10.3389/fvets.2025.1556965/full
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