Nature | 单分子RNA荧光成像研究干细胞转录动力学

检验之星

原创 小颂 图灵基因 今天
来自专辑  前沿分子生物学机制


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撰文：小颂
IF= 43.07
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亮点：利用单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）技术测量小鼠干细胞编码转录因子的三个关键基因的转录动力学：PU.1，Gata1和Gata2。
6月24日在顶级学术期刊《Nature》上发表了一篇名为“Single-molecule imaging of transcription dynamics in somatic stem cells”的文章。来自美国爱因斯坦医学院的Ulrich Steidl教授团队，利用单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）技术测量小鼠干细胞编码转录因子的三个关键基因的转录动力学，包括PU.1，Gata1和Gata2。最终发现一些少量突发情况会导致造血干细胞和祖细胞中的拮抗转录因子共表达。同时对其谱系进行分析发现，尽管单个干细胞克隆产生的细胞处于转录的相关状态，但是其状态间存在的过渡动力学过程可以通过随机和可逆的模型获得。


对生物系统进行定量单细胞的研究表明，随机性是所有细胞过程都会存在的。由于低拷贝数波动，反应的空间和时间划分以及限制有效反馈控制的严格物理界限，基因表达不可避免地会产生噪声。干细胞生物学中的一个基本问题是，成熟的细胞类型如何从这些固有的随机过程中大量产生。下图是造血干细胞的分化过程。单细胞RNA测序研究表明，由于在多步分化过程中越来越受限的祖细胞，位于造血干细胞的末端分支的基因表达会较早且连续的出现。转录因子被认为在此过程中起着核心作用，在谱系指定过程中协调靶基因群组的表达。因此，在确定编码转录因子的基因表达中转录噪声的大小是至关重要的。


转录噪声的定量评估需要具有分子敏感性的单细胞技术。因此采用了单分子荧光原位杂交技术来研究原代造血干细胞和祖细胞（HSPC）中的转录噪声。由于某些关键的造血转录因子的mRNA长度短和（G+C）含量高，所以选择了两步杂交策略来提高信噪比（如图）。首先测试了PU.1基因表达，该基因编码的转录因子在髓样细胞的发育中具有重要的激活功能，是红系分化的阻遏物，其表达在白血病发生过程中被下调。与商用探针相比，两步法的单分子荧光原位杂交技术可显着提高信号强度，信噪比和每个细胞可检测的PU.1的 mRNA数量。随后将此方法扩展为在三个通道中进行多重成像，从而可以同时检测单个细胞中的三个基因。


随后使用单分子荧光原位杂交技术评估了随机性在PU.1与Gata转录因子基因Gata1和Gata2之间转录调控的作用。PU.1和Gata1分别对沿粒细胞-单核细胞和红细胞谱系的分化至关重要，两者之间在造血干细胞分化过程中相互拮抗。Gata2在早期的造血干细胞中含量丰富，并且能够通过拮抗PU.1的功能而起到类似于Gata1的作用，但是作用效果较低。而当Gata1开始占据主导位置时，细胞开始成熟，同时会抑制Gata2的表达。然而，最近的单细胞RNA测序的研究或是未能检测到共表达PU.1和Gata1的祖细胞，或是仅在少数细胞中检测到了共表达，使得这种模型在指导髓样细胞方面的有效性受到质疑。于是选取三种细胞群体进行分析：粒细胞/单核细胞祖细胞（GMP），巨核细胞/红细胞祖细胞（MEP）和普通骨髓祖细胞（CMP），并通过单分子原位荧光杂交技术评估了这些转录因子的表达（图1d）。Gata1在MEP中较高，在GMP中较低，而PU.1在GMP中较高，在MEP中较低。Gata2在CMP中最高。值得注意的是，在所有情况下（除了GMP中的PU.1和MEP中的Gata1），发现mRNA计数分布均呈正偏，大多数概率质量低于每个细胞50个mRNA拷贝。这种类型的频率分布是不频繁的转录爆发中产生的mRNA的典型特征。并且即使在高表达细胞类型中，所有的基因也罕见地处于“打开”的状态。


考虑到活性位点的频率不高以及每个基因的拷贝数相对较低，所以评估了这些基因的共表达频率。大多数CMP表达：PU.1（97％），Gata2（96％）和Gata1（64％）。然而在超过60％的CMP以及45％的MEP和89％的GMP中所有三个基因均具有至少一个mRNA（如图）。
接下来探索了CMP是否仍在积极转录PU.1和任一Gata基因，或者在分化的这一阶段是否排除了这些因子的共转录。结果表明在CMP中不会发生拮抗转录因子PU.1和Gata1或Gata2的互斥转录。


从CMP数据推断出的转录参数进行了随机模拟，以模拟每个基因随时间的转录行为。为了优化参数拟合，将CMP分配给四个转录状态：PU.1highGata1 / 2low状态（P1H）；Gata1 / 2highPU.1low状态（G1 / 2H）；Gata2high状态（G2H）；以及所有三个基因的低表达状态（LES CMP）。用扩散伪时间估计对这些状态进行排序（如图），可以确定从LES CMP集群发出的两个分支。与先前的分析一致，尽管伪时间图中的每个分支都有不同的转录活性，但即使在伪时间内，沿着给定分支，仍检测到了“相反”转录因子的活跃转录位点。随后使用单分子原位荧光杂交技术测得的数据推断出每种状态的转录速率参数。使用给定状态的参数模拟的单细胞轨迹非常接近每个状态的转录行为，并且非常稳定。然后使用这些模拟来推断在体外CMP寿命的典型时间范围内，每种状态下产生的新生mRNA的累积数量。在这段时间内，大多数轨迹转录了数百个Gata2副本，而与转录状态无关。模拟的LES CMP和G2H CMP分别为Gata1和PU.1转录了20至100个mRNA。平均而言，仅在模拟两小时后，预计LES细胞将包含所有三个基因的mRNA，并且在12小时模拟窗口中的某个时刻，有超过99％的细胞为“三重阳性”。尽管每个状态的参数集都生成了稳定的轨迹，并在很大程度上维持了它们的初始状态分配，但也会发生向其他状态的罕见转变。因此，我们通过首先将细胞初始化为LES状态来重复模拟，并且仅通过波动即可使细胞过渡到其他状态，然后它们将采用新的转录参数。在LES状态下初始化的轨迹中，有9％和18％的轨迹在CMP后分别在G1 / 2H或P1H终点结束，而25％的轨迹在G2H状态结束。在终端G1 / 2H和P1H状态下结束的轨迹经常在LES和G2H状态下进出波动。这些分析表明，尽管转录噪声驱动拮抗转录因子的共表达，但嘈杂状态的随机和可逆转变仍然可以有效地分为PU.1high和Gatahigh表达状态。


尽管以上结果表明CMP中存在相当大的转录随机性，但此类现象是否在造血干细胞中发生是一个关键问题。同时此类过程对造血干细胞中PU.1-Gata1网络的转录状态是否影响，并且有人提出“转录启动”被认为限制了造血干细胞及其后代可以占据的转录状态。首先研究了造血干细胞是否共表达PU.1和Gata基因。造血干细胞及其早期子代显示了所有三个基因的强表达，其表达水平与CMP相似，其中超过99％的细胞表达PU.1和Gata2，而55％的细胞共表达所有三个mRNA。接下来，为了了解这些基因的时间动态是如何协调的，使用了亲缘相关分析，可以利用谱系中嵌入的信息来推断转录状态转变的动态。为此，对造血干细胞进行了96 h的离体追踪，从每个造血干细胞构建了谱系，并使用单分子原位荧光杂交技术为细胞分配了转录状态（如图）。随后研究了单个造血干细胞是否可以在多种状态下产生后代。为了确定哪种状态组合可以源自单个克隆，计算了混合细胞中状各态的频率。尽管在此分析中没有两个是互斥的，但同时发现具有G1 / 2H和P1H州的细胞群的频率很低。产生任何G1 / 2H后代的造血干细胞的细胞群显示P1H细胞的频率降低十倍，G1 / 2H细胞的频率升高十倍，G2H细胞增加1.5倍。同样，在G2H状态下具有任何终点后代的细胞群，P1H和LES细胞状态下的细胞频率降低，而G1 / 2H状态下的细胞频率增加了近两倍。相反，产生P1H细胞的克隆的G1 / 2H细胞减少了三倍，而G2H细胞减少了四倍。可以解释这种行为的一种情况是在谱系早期出现的转录动力学的不可逆转。这些结果表明，向高表达状态的转变要么不可逆转但发生得很晚，要么不频繁且可逆。


为了区分这些互斥的假设，使用了KCA，它利用终点转录状态与谱系中细胞之间的谱系距离之间的相关性来推断这些状态的转化率（如图）。使用谱系和单分子原位荧光杂交数据，首先确定了跨越所有世代距离和跨越所有边缘的过渡矩阵。与保留亲本细胞状态的可能性相比，任何两个状态之间的推断转变率都相对较低，这与观察到大多数细胞尚未转变为P1H或G1 / 2H状态相一致。接下来，使用这些转移概率来建模一系列状态转移行为，从完全不可逆的承诺链（模型I）到完全连接的网络（模型IV）。通过确定每个模型预测的三细胞状态频率与实验中观察到的频率之间的误差，比较了这些模型的预测能力。在测试的所有世代距离上，与不可逆模型（模型I）和部分不可逆（模型III）模型相比，马尔可夫链（模型II）和完全连接模型（模型IV），预测的三单元状态频率误差分别降低了约100％和30％。此外，马尔可夫链在较小的世代距离v下表现更好。总体而言，在所测试的模型中，包含向P1H和G1 / 2H状态可逆转换的状态转换模型要优于具有不可逆转换的状态转换模型，并且马尔可夫链模型可以最好地捕获潜在的状态转换。随后研究发现沿着任何轨迹的大部分时间都花费在LES和G2H状态上，包括那些产生P1H或G1 / 2H终点状态的时间。因此，受这些参数控制的马尔可夫链可以在单个造血干细胞的克隆后代中导致类似启动的行为，而无需早期，不可逆的状态转换或无噪音的转录调控。该分析表明，即使细胞的当前转录状态（由三个基因PU.1，Gata1和Gata2编码）可能会在短期内可获取状态的概率分布发生偏差，但也无法完全预测该细胞的祖先或后代所访问的过去或将来的状态。


如何从固有的噪声过程中产生出强大的细胞表型，这是研究组织形态发生和机体动态平衡至关重要的问题。本篇文章尝试使用单分子成像和谱系的定量分析来定量解决初级造血干细胞中转录因子基因表达中的噪音问题。结果表明，拮抗转录因子在大多数造血干细胞和祖细胞中共表达，并且由这些基因定义的转录状态之间的随机转变是系统动力学的基础。由于这些动力学通过利用基因表达的物理内在噪声来产生稳定性，因此这些研究的结论可能反映出一个重要的原则，即对后代的进化至关重要的干细胞和祖细胞特性。因此，确定这些报道的现象是否在其他组织系统中占主导地位对于对机体动态平衡以及对起源于组织驻留在干细胞区域或受其影响的疾病的病理生物学的定量理解至关重要。
教授介绍


Ulrich Steidl教授，阿尔伯特·爱因斯坦医学院细胞生物学和医学教授。还是蒙特菲奥医疗中心肿瘤学转化研究的副主席。研究重点：白血病干细胞的失控干细胞的机制研究；包括骨髓增生异常综合症（MDS）和急性髓性白血病（AML）在内的骨髓恶性肿瘤干细胞起源的研究；实验室开发和完善了功能和机制研究的独特实验工具，包括转录和表观遗传调控以及干细胞水平及其针对性治疗的新方法。他的工作促成了几个重要发现，这些发现为许多当前的研究方向和合作奠定了基础，并促进了针对血液系统恶性肿瘤患者的创新性临床试验的启动。
参考文献1. Wheat, J. C. et al.Single-molecule imaging of transcription dynamics in somatic stem cells. Nature(2020).

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