『759检综--免疫 04』抗血清的制备

千姿百态

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这部分的重点在于单克隆抗体的制备，所以这部分的内容一定要好好背。半抗原、免疫佐剂这部分也要好好记一下。
一、免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
（一）颗粒性抗原：各种细胞、细菌、寄生虫。细胞抗原（如绵羊红细胞）
一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂作皮内注射。
（二）可溶性抗原的制备
第一步 单个细胞获得的方法（1）机械捣碎（2）酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶
第二步 细胞破碎方法有：（1）超声破碎法（2）酶处理法，常用溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶（3）冻融法（4）表面活性剂处理法（二）可溶性抗原的纯化
1、超速离心法 仅适用于少数大分子抗原及一些比重较轻的抗原，而不适用于大多数中小分子抗原。
2、选择性沉淀法
（1）核酸去除法 可采用氯化锰、硫酸提取鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂。核糖核酸降解法更简便（采用 DNA或 RNA酶）。
（2）盐析法 常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。
（3）有机溶剂沉淀法 常采用乙醇或丙酮。
（4）聚合物沉淀法 常用非离子型聚合物，如分子量为 2000～6000的聚乙二醇（PEG）。
3、凝胶过滤法 又名分子筛层析，利用分子筛作用对抗原进行分离。凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质，制备成层析柱，样品中大、小分子物质运动轨迹不一致从而分离。
4、离子交换层析
利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。由于各种蛋白质的等电点不同，所带的电荷量不同，与纤维素（或凝胶）结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而将血清中不同生物学特性的蛋白质分别洗脱分离。
5、亲和层析
利用生物大分子间所具有的相互针对性，例如抗原和抗体、激素和受体等，二者能紧密地结合成复合物，在一定条件下又可解离。如果将复合物的已知一方固定在固相载体上，则可从溶液中专一性地分离和提纯另一方。
（1）亲和层析支持物的选择 常用的有琼脂糖珠（sepharose2B、4B、6B）、琼脂糖、聚丙乙烯酰胺、多孔玻璃球等。
（2）抗原或抗体与支持物的结合 载体结合法、物理吸附法、交联法和网络法。
（三）免疫球蛋白片段的制备
五种免疫球蛋白都具抗原性，皆可提取及纯化，但如分解成片段（如 Fab片段、Fc片段、轻链片段等）作为免疫原可制备出分辨力更高的特异性抗血清。
（1）解离二硫键
（2）溴化氰裂解法
（3）酶解法
1）木瓜酶可将 IgG裂解成 2个 Fab片段及 1个 Fc片段。
2）胃蛋白酶可将 IgG裂解成 F（ab’）2片段及数个小片段。
3）胰蛋白酶可将 IgG切成不规则的肽链。
（四）半抗原
1、半抗原(hapten) 是指只有抗原性而无免疫原性的物质，如多肽、多糖、甾族激素、核苷、某些药物以及其他化学物质等。半抗原不能直接用做免疫原，只有把半抗原与蛋白质等大分子物质结合后，才能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。
2、载体
(1) 蛋白质类 以牛血白蛋白最常用。
(2) 多肽聚合物 常用多聚赖氨酸。
(3) 大分子聚合物和某些颗粒 聚乙烯吡咯烷酮、药用炭、羧甲基纤维素等皆常用。
3、半抗原与载体连接的物理法、化学法的原理。
(1) 物理吸附其原理是通过电荷和微孔吸附半抗原，载体有硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素等。
(2) 化学法则是利用功能基团将半抗原连接到载体上，载体有血清白蛋白、多聚赖氨酸等
（五）免疫佐剂
1、定义：免疫佐剂(immunoadjuvant)是指那些与抗原一起或先于抗原注入机体后可增强机体对该抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的物质。佐剂可以具备免疫原性，也可无免疫原性。
2、分类：福氏不完全佐剂（石蜡油+ 羊毛脂）福氏完全佐剂（石蜡油+ 羊毛脂+ 卡介苗）PS：抗原与佐剂需形成油包水乳剂，佐剂和抗原的比例为 1：1。乳化的方法有两种：①研磨法②搅拌混合法。
3、佐剂的免疫作用机制。
(1) 改变抗原的物理性状，延缓抗原降解，延长抗原在体内的停留时间，从而有助于抗原提呈细胞(APC)对抗原的摄取。
(2) 诱导产生炎症反应，吸引APC到达炎症感染部位并使之活化，增强APC对抗原的加工和提呈。
(3) 刺激淋巴细胞的增殖分化，增强和扩大免疫应答。
2、佐剂的生物学作用。
(1) 增强抗原免疫原性,使无或弱免疫原性的物质成为持久或强免疫原。
(2) 增强机体对抗原刺激的反应性，提高机体初次和再次免疫应答产生抗体的效价。
(3) 促进抗体类型转换，使产生的抗体由IgM转变为IgG。
(4) 引起或增强迟发型超敏反应。


二、抗血清制备
1、抗血清的分为 R型和 H型
R型抗血清（R型抗体）是用抗原免疫家兔及其他小型动物所产生的抗体，该抗体具有较宽的抗原抗体比例范围，适于作诊断试剂。
H型抗血清（H型抗体）用抗原免疫马等大型动物所产生的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较窄，一般用于免疫治疗
2、抗血清制备的主要步骤：
① 菌液（颗粒性抗原）制备
② 颗粒性抗原免疫家兔
③ 可溶性抗原（人IgG）免疫家兔免疫血清采集和保存
⑤抗体的鉴定3、抗血清的鉴定和保存
（1）抗体特异性的鉴定 常用双向免疫扩散法 观察沉淀线若粗抗原及纯抗原之间皆出现一条沉淀线，且两者互相融合，则证明该动物已产生单价特异性抗体。若纯化抗原出现一条，而粗抗原出现多条线，且其中一条沉淀线与纯抗原沉淀线相连接，免疫成功。若不出现沉淀线，表示免疫失败。
（2）抗体效价和纯度的测定效价的测定，颗粒性抗原采用凝集试验。可溶性抗原采用双向免疫扩散试验、ELISA。纯度的测定，采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、双向免疫扩散试验、免疫电泳等方法。
（3）抗体亲和力的测定
（4）抗血清的保存
① 2～8℃保存：用于短期保存
② 冷冻保存：是常用的抗体保存方法
③ 将抗体分为小包装，在-80～-20℃保存，一般可保存 5年，效价不会明显下降，但应避免反复冻融。
④ 真空干燥保存：用真空冻干机进行干燥，封装后可长期保存，一般在冰箱中可保存 5～10年。
4、抗体的纯化
（1）特异性IgG抗体 盐析法 （多采用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法） 、凝胶过滤法 、离子交换层析法 、亲和层析法
（2）单价特异性抗血清：亲和层析法、吸附剂方法


三、单克隆抗体制备
1、单克隆抗体。
优点：结构高度均一，其抗原结合部位和同种型都相同；纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应等特点。广泛应用：诊断试剂、抑制剂、导向药物。
2、叙述杂交瘤技术制备单克隆抗体的三个基本原则。
基本原理是根据以下三个原则：①淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种（个）克隆只产生一种抗体；
②细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；
③利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的McAb 。
3、B淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理及主要步骤。
(1) 原理：利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基的作用，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得既能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。
(2) 主要步骤：①两种亲本细胞的选择与制备②细胞融合③杂交瘤细胞的筛选与克隆化、批量生产单克隆抗体。
PS：l 阳性杂交瘤细胞的筛选：杂交细胞经约10—14d培养后，形成可用的细胞集落（克隆）。经过几次更换培养液（HT培养液）后进行抗体活性检测。常用的筛选检测方法是ELISA和凝集试验，前者常用于可溶性抗原，后者适用于细胞、细菌等表面抗原。此外，Dot－ELISA、免疫印迹及免疫荧光试验均可用于杂交瘤细胞的筛选。
l 克隆化：使许多细胞克隆混合生长的细胞分离为单个的细胞克隆的过程称克隆化（colonization）。最常用的单克隆化方法是有限稀释法（limiteddilution），即将混合细胞经稀释后分装于培养板上，使培养板的大部分孔中只出现一个细胞。
4、细胞DNA合成的两条途径。①主要合成途径，利用糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而叶酸拮抗剂-氨基蝶呤可阻断该途径；②补救途径，当叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），利用核苷酸的前体（次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷）合成核苷酸，进一步合成DNA。
5、应用HAT培养基作为杂交瘤技术的选择性培养基的原理。
HAT培养基—基础细胞培养液中加次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T） 。HAT选择培养液中的A可阻断细胞的叶酸代谢，迫使细胞通过补救途径，依靠HGPRT利用培养液中的H和T合成DNA。
在HAT培养基中，进行细胞融合后，骨髓瘤细胞及其相互融合的同核体细胞有TK，但缺乏缺乏HGPRT，不能完成完整的DNA合成过程。小鼠脾细胞及其相互融合形成的同核体细胞，虽有HGPRT，但缺乏无限增殖的能力，也会死亡。只有杂交瘤细胞由于具有两种亲代细胞的染色体，拥有HGPRT可以在HAT培养基中选择性存活下来并增殖。
HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转换酶
6、兔McAb与鼠McAb相比有如下优点:
① 兔McAb在ELISA试验和免疫组化中拥有更高的亲和力和特异性;
② 兔McAb能够识别许多在小鼠中不产生免疫应答的抗原;
③由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能;
④与鼠McAb的人源化相比，兔McAb的人源化更容易。
7、McAb的应用
(1) 临床检验诊断试剂 单克隆抗体特异性强、纯度高、均一性好等优点，被广泛用于酶ELISAS、免疫组化、RIA和流式细胞等技术。
(2) 蛋白质的纯化 使用亲和层析法中McAb可以作为配体与琼脂糖交联，对目标蛋白进行纯化。
(3) 肿瘤的导向治疗 将针对某一肿瘤抗原的McAb作为载体，连接上化疗药物或放疗物质，定向杀伤肿瘤细胞。
(4) 放射免疫显像技术 将放射性核素与某肿瘤抗原特异性McAb连接，并注入患者体内，这种McAb与肿瘤细胞表面的抗原结合，而使肿瘤组织内放射性异常聚集，通过放射免疫显像来辅助肿瘤的诊断。
8、单克隆抗体的特性
(1) 高度特异性(2) 高度的均一性和可重复性(3) 弱凝集反应和不呈现沉淀反应(4) 对环境敏感性



好啦！今日分享就到这儿啦 搬砖人要下班了。


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