『759检综--免疫 08』固相酶免疫和免疫组化技术

John

大家好，我是尼古拉斯.辣梨。
今天要跟大家分享的是，固相酶免疫和免疫组化技术的重要知识点。
这个部分的重点比较明显，大家直接跟着文章来就好了。免疫组化部分的亲和素-生物素免疫组化技术，记得集合亲和素-生物素章节一起看。
让我看看还有哪个小婊贝，
只白嫖，不点赞、不收藏、不认真学。
就.......


明白意思了吧！？
话不多说！开整！
Part one 固相膜免疫技术

一、基础知识：

1、胶体金免疫技术(colloidal gold immunoassay)是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。
2、胶体金结合物（Conjugate）即免疫金：胶体金与抗原或抗体等大分子物质的结合物，习称金探针，蛋白质被吸附到胶体金颗粒表面，机制不清（负电荷、粗糙表面等）。
3、免疫金标记技术：免疫金标记技术利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标志物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。
4、荧光免疫层析试验：标记物为荧光素，标记相应的抗体或抗原，然后利用荧光检测仪检测试剂条上富集的反应结合物激发产生的荧光强度，从而对标记物浓度进行检测的一种方法。
5、胶体金免疫层析试验：标记物为胶体金，多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。
6、微孔膜，非共价键高度吸附抗体或抗原，标记物用酶或各种有色微粒（常用胶体金）。
分： 免疫渗滤试验（FIA）：穿流形式、免疫层析试验（ICA）：横流形式。
二、免疫层析试验

1、免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）
以NC膜等为固相载体，样品溶液借助毛细作用在层析条上泳动，同时样品中的待测物与层析材料.上待测物的受体发生免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过目测或仪器检测标记物-胶体金颗粒或荧光素等，在20分钟以内聚集而得到直观的实验结果(显色),游离标记物与结合标记物自动分离。
2、技术要点：将试剂条标记线一端浸入待测标本中 2～5秒或在标本加样处加一定量待检标本，平放于水平桌面上。在5～20分钟内观察结果。
3、方法类型：双抗体夹心法测抗原、竞争法测小分子抗原 间接法测抗体
4、结果判断：阴性为出现 1条棕红线条带；阳性为出现 2条棕红线条带；无棕红线条带出现为试剂失效。
5、应用
(1) 正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物等）。
(2) 正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如 HCG等）的检测。
三、免疫渗滤试验

1、斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)
是将抗原或抗体点加在固相载体NC薄膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上，依次在膜上滴加样品、免疫胶体金及洗涤液等试剂并与NC膜上的相应抗原或抗体发生反应，起到亲和层析的浓缩作用，达到快速检测的目的。抗原-抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。
2、操作：加少量（1～2μl）抗原于膜上，由于 NC膜吸附能力强，故需在干燥后进行封闭；然后 滴加样品血清，其中的待检抗体即与 NC膜上抗原结合；洗涤后再滴加酶标二抗，最后滴加能形成不溶有色物的底物（如 HRP标志物，常用二氨基联苯胺）；
3、结果判断：阳性者即可在膜中央出现肉眼可见的染色斑点。反之阴性。
四、免疫印迹法(immunoblotting test, IBT)
1、免疫印迹试验(immunoblotting test, IBT)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫反应相结的检验技术，又称为Western blot。Western blot技术是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，具有分析容量大、分辨率高、分析敏感度高的特点。
2、原理：
(1) 将混合抗原样品在凝胶上进行单向或双向电泳分离，然后取固定化基质膜与凝胶相贴，在印迹膜的自然吸附力、电场力或其他外力作用下，使凝胶中的抗原组分转移到固相载体上，如NC膜、尼龙膜等。
(2) 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体进行抗原和抗体反应，再与酶、荧光素、发光剂或放射性核素等标记的第二抗体进行反应。
(3) 经过底物显色、荧光或发光检测或放射自显影对特异性蛋白进行检测和分析
用于病原体特异抗体如人类免疫缺陷病毒抗体的确认试验，将病毒天然抗原以上述方式预先转印于膜上，然后直接进行后续的检测步骤。
3、重组免疫印迹试验(recombinant immunoblot assay, RIBA)属于免疫印迹试验，在临床检测中将一种或多种诊断抗原包被在NC膜条上，用于病原体抗体的确认试验和自身抗体的检测等。
（1）应用：
①　临床上用ELISA进行大样本的初筛，对阳性或可疑标本进行确认和抗原成分分析时,经常用RIBA。如血清抗-HCV抗体的测定和分析。
②　RIBA在临床上还用于对不同自身免疫性疾病的诊断与鉴别诊断，如对ENA自身抗体谱(包括抗Sm、抗U1RNP、抗ssA、抗ssB、抗Jo-1、抗Scl-70等)的检测，有助于多种系统性自身免疫性疾病的诊断与鉴别诊断，有助于进行疗效判别和愈后评价。
Part two 免疫组化技术

一、基本概述：

1、定义
是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术。
2、 基本过程包括：
①抗原的提取与纯化；
②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；
③将标志物与抗体结合形成标记抗体；
④标本的处理与制备；
⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；
3、常见的免组技术技术
l酶兔疫组化技术
定义：是在一定条件下应用酶标抗体(抗原)与组织或细胞标本中的抗原(抗体)发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜识别标本中抗原(抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析。最常用的酶是辣根过氧化物酶，常用的供氢体有二氨基联苯胺（DAB）；
分类：可分为酶标记抗体兔疫组化技术和非标记抗体酶兔疫组化技术两种类型。
Ø 酶标记抗体的基本原理：
(1) 直接法
将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物， 最后用酶底物显色。
优点：操作简便及特异性强，缺点：敏感性低，制备的抗体种类有限。
(2) 间接法
将酶标记在二抗上，先将一抗（特异性抗体）与相应的组织抗原结合 ，形成抗原抗体复合物，再用二抗（酶标抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。
优点：检测敏感性高，制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体。
缺点：特异性不如直接法，操作较为复杂。
Ø 非标记抗体酶免疫的常见类型：
(1) 酶桥法
抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将识别组织抗原的一抗与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物。
(2) PAP法
首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物）。通过桥抗体（第二抗体），将识别组织抗原的一抗与 PAP复合物的抗酶抗体连接起来。
(3) 双桥PAP法
在PAP法中通过两次连接桥抗体和 PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。
(4) APAAP法碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法
APAAP 法就是用碱性磷酸酶代替 HRP建立的碱性磷酸酶（AP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，即简称 APAAP。
2、荧光免疫组织化学技术
（1）常见的标本类型1.涂片和印片 2.组织切片 3.细胞培养标本 4.活细胞染色
（2）保存方法
标本在固定干燥后，最好立即染色及镜检。如必须保存时，则应保持干燥，置 4℃以下保存。但病毒和某些组织抗原标本，需在－20℃以下保存。一般细菌涂片或器官组织切片经固定后可保存 1个月以上。
3、与荧光免疫技术相比，酶免疫组织化学技术的优点：酶免疫组化具有染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点，尤其是非标记抗体，敏感性更优。


二、 影响免疫组化的主要影响因素

（一）标本的处理
1、标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞。
2、标本的固定与保存
标本固定的目的；固定剂的选择；制片方法的评价；
（1）固定的意义。
(1) 使细胞内蛋白质凝固，抑制细胞自溶，保持细胞的形态结构；
(2) 保存组织细胞的抗原性;
(3) 防止标本脱落;
(4) 除去类脂，便于保存;
(5) 抑制细菌繁殖，防止组织腐败和在后续制备中的细胞结构和成分的改变。
固定原则：不损伤细胞形态、不干扰固定后抗原的识别和结合力。
（2）如何选择固定剂？
原则：必须根据固定剂的性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。
(1) 蛋白质类抗原——乙醇或甲醇；
(2) 微生物抗原——丙酮或三氯化碳固定;
(3) 病毒的蛋白质外壳——胰蛋白酶;
(4) 多糖抗原——10%甲醛固定或以微火加热固定；
(5) 黏液物质——透明质酸酶;
(6) 类脂质——有机溶剂(乙醚、丙酮等)处理
（3）冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。最大程度保存抗原首选冷冻切片，回顾性研究选择石蜡切片。
（二）抗原的保存与修复
1.酶消化法；
2.盐酸水解法；
3.微波法；
4.高压锅法；
5.煮沸法
（三）抗体的处理与保存
1、抗体的选择
要选择具有高度特异性和稳定的抗体。根据需要决定采用单克隆或多克隆抗体。
多克隆抗体广泛用于石蜡包埋的组织切片，假阴性几率低，但特异性不如单克隆抗体。单克隆抗体特异性强，但敏感性不够高。
2、抗体的稀释
实际操作中需进行预实验，找到抗体的最佳稀释度，以便达到最小背景染色下的最强特异性染色。
3、抗体的保存
保存抗体时，要注意保持抗体的生物活性，防止抗体蛋白质变性，否则会降低抗体效价，甚至失效。


三、免疫组化的结果判断

（一）对照的设立
设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体进行，常用的对照有阳性对照和阴性对照。
1. 阳性对照  对照切片的阳性将证明整个显色程序的正确。阳性细胞的显色分布有三种类型：①细胞质；②细胞核；③细胞膜表面。呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。阳性细胞可呈散在、灶性和弥漫性分布。
2. 阴性对照  只有在阴性对照成立时,方可判定检测结果。主要目的在于排除假阳性。
3.其他空白、替代、吸收或阻断试验均为确证试验。
（二）特异性和非特异性显色的鉴别
1、特异性反应 常分布于特定抗原部位，如细胞质、细胞核和细胞表面，具有结构性。
2、非特异性反应无一定的分布规律，常为切片边缘、刀痕或皱褶部位，坏死或挤压的细胞区域，常成均匀亮色。


好啦！今日分享就到这儿啦 搬砖人要下班了。


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