手把手教你菌落PCR的实验操作步骤

生物科研实验室

一、菌落PCR的原理 菌落PCR的核心在于直接利用菌体裂解释放的质粒DNA作为模板。通过高温（通常是95℃）预变性步骤，细菌细胞壁被破坏，质粒DNA释放到反应体系中。随后，特异性引物与目的片段结合，在Taq酶  的催化下完成扩增。整个过程省去了质粒提取的繁琐步骤，只需挑取单菌落  即可快速检测，特别适合大规模筛选阳性克隆。 关键点：菌落PCR对引物设计要求较高，通常需要针对插入片段或载体多克隆位点两侧设计引物，确保扩增出目标条带（例如插入片段或载体骨架的特异性序列）。 二、实验前的准备工作 1. 试剂与仪器清单 •试剂： •2×Taq PCR预混液（含Buffer、dNTP、Taq酶） •特异性引物（正向和反向引物，稀释至10 μM） •无菌水或TE缓冲液 •阳性对照（已知含有目的片段的质粒） •琼脂糖凝胶电泳相关试剂（核酸染料、Marker、电泳缓冲液等） •仪器与耗材： •PCR仪 •微量移液器  及灭菌枪头 •灭菌牙签或枪头（用于挑菌落） •冰盒 •离心机（可选） 2. 实验设计要点 •引物设计： •若验证插入片段，引物需跨多克隆位点  （例如载体上的通用引物M13-F/R）。 •若验证载体是否正确，可设计载体特异性引物。 •建议扩增片段长度控制在500-2000 bp，过长可能降低效率。 •设置对照： •阳性对照：已知含有目的片段的质粒，确保PCR体系正常。 •阴性对照：不加模板或使用空载体菌落，排除污染或非特异性扩增。 三、菌落PCR标准操作步骤
步骤1：挑取菌落 •用灭菌牙签或枪头轻轻蘸取平板上的单菌落（注意不要戳破琼脂）。 •将带菌牙签直接放入预先准备好的PCR管中（管内已加入10-20 μL无菌水或裂解缓冲液），轻微搅动后丢弃牙签。 •关键细节： •菌量宜少不宜多！过多菌体会抑制PCR反应，导至假阴性。 •若菌落较大，可先用牙签刮取少量菌体，避免整块挑取。 步骤2：菌体裂解（预变性） •将PCR管置于PCR仪中，95℃加热5-10分钟，裂解细菌释放质粒DNA。 •裂解后立即将管子置于冰上冷却2分钟，防止DNA高温降解。 •替代方案：若实验室条件允许，可先离心（12000 rpm，1分钟）沉淀细胞碎片，取上清作为模板，减少杂质干扰。 步骤3：配制PCR反应体系   以下为25 μL体系的参考配方（根据预混液说明调整）： 组分 体积（μL）  2×Taq预混液 12.5  正向引物（10 μM） 1.0  反向引物（10 μM） 1.0  模板（裂解液） 1.0  无菌水 9.5    •混匀技巧：轻弹管壁或短暂离心，避免剧烈震荡产生气泡。 步骤4：设置PCR程序 根据引物Tm值设定退火温度，以下为通用程序（以扩增1 kb片段为例）： 步骤 温度 时间 循环数  预变性 95℃ 5 min 1  变性 95℃ 30 sec   退火 55-60℃ 30 sec 30  延伸 72℃ 1 min/kb   终延伸 72℃ 5 min 1  保存 4℃ ∞     步骤5：电泳检测结果 •取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（浓度1%-2%），使用DNA Marker比对条带大小。 •预期结果：阳性样本应出现清晰的目的条带，阴性对照无条带。 四、常见问题与解决方案
1. 假阴性（无条带） •原因：菌量过多、裂解不彻底、引物设计错误、退火温度过高。 •解决：减少菌量；延长预变性时间；重新设计引物或优化退火温度。 2. 非特异性条带 •原因：引物二聚体、基因组DNA污染、退火温度过低。 •解决：提高退火温度；设置阴性对照；使用热启动Taq酶。 3. 阳性对照失败 •检查：预混液是否失效？引物是否降解？PCR程序是否设置错误？ 4. 电泳有条带但测序失败 •可能：引物扩增了非目标片段，建议重新设计引物或优化反应条件