实验技术干货 | GPX4酶活性测定的实验步骤和注意事项

生物科研实验室

一、实验原理
GPX4酶活性测定的基本原理是基于其催化GSH与过氧化氢（H₂O₂）反应的能力。在GPX4的作用下，GSH被氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），同时H₂O₂被还原为水。通过检测反应体系中GSH或GSSG含量的变化，或者利用与GSH或GSSG相关的偶联反应，产生可检测的信号（如吸光度变化、荧光信号等），从而间接测定GPX4的酶活性。

目前常用的测定方法是利用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）与GSH反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子，通过在412nm处测定吸光度的变化来间接反映GSH的消耗，进而计算出GPX4的酶活性。

三、实验材料与试剂（一）材料
1. 细胞样本或组织样本：根据实验目的选择合适的细胞系或组织，如培养的细胞、动物肝脏组织等。在采集样本时，要注意样本的新鲜度和保存条件，尽量减少样本在空气中的暴露时间，避免氧化损伤对酶活性的影响。

2. 离心机：用于细胞或组织匀浆的离心分离，一般选择转速可达10000 - 15000rpm的离心机。

3. 低温高速离心机：用于蛋白质的分离和纯化步骤，转速要求更高，通常在20000 - 30000rpm以上。

4. 酶标仪：用于测定反应体系的吸光度，具备412nm波长检测功能。

5. 96孔板：选择透明的平底96孔板，用于酶活性测定的反应体系。

（二）试剂
1. 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）：用于样本的清洗和稀释，配制方法为：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄，加入800mL去离子水溶解，用HCl或NaOH调节pH至7.4，最后定容至1L。

2. 细胞裂解液：常用的有含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液。可根据说明书进行配制和保存，确保在使用时裂解液中的蛋白酶抑制剂有效发挥作用，防止蛋白质降解。

3. 100mM GSH溶液：准确称取适量的GSH，用PBS溶解并定容，配制成100mM的储备液。由于GSH容易被氧化，储备液应分装后保存在-20℃，使用时避免反复冻融。

4. 20mM H₂O₂溶液：用去离子水将30%的H₂O₂溶液稀释成20mM的工作液。H₂O₂具有强氧化性，稀释过程中要注意防护，避免接触皮肤和眼睛，且工作液应现用现配，防止其分解。

5. 10mM DTNB溶液：称取适量的DTNB，用PBS溶解并定容至10mM。DTNB溶液应避光保存，若溶液颜色变深则表示已被氧化，不宜再使用。

6. 酶稀释缓冲液：可选用含一定浓度甘油、BSA和蛋白酶抑制剂的缓冲液，用于稀释GPX4酶样品，保持酶的活性和稳定性。

四、实验步骤（一）样本制备1. 细胞样本培养细胞至对数生长期，用PBS清洗细胞2 - 3次，以去除培养液中的血清和杂质。加入适量的细胞裂解液（每10⁶个细胞加入100 - 200μL裂解液），在冰上孵育30分钟，期间轻轻晃动培养皿，使细胞充分裂解。将裂解后的细胞悬液转移至离心管中，在4℃下以12000rpm离心15分钟，取上清液，即为细胞裂解物。将上清液分装后保存在-80℃备用，避免反复冻融。
2. 组织样本取适量新鲜的组织（如肝脏、肾脏等），用预冷的PBS冲洗干净，去除表面的血液和杂质。将组织剪成小块，放入玻璃匀浆器中，加入适量的预冷PBS（组织与PBS的比例一般为1:5 - 1:10），在冰上进行匀浆，直至组织完全破碎。匀浆过程中要注意保持低温，避免酶活性的损失。将匀浆液转移至离心管中，在4℃下以10000rpm离心20分钟，取上清液，即为组织匀浆上清液。同样将上清液分装后保存在-80℃备用。
（二）蛋白定量
采用BCA法或Bradford法对制备好的细胞裂解物或组织匀浆上清液进行蛋白定量。1. BCA法准备标准蛋白溶液（如BSA，浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL）和待测样本，每个样本设置3个复孔。在96孔板中，分别加入20μL的标准蛋白溶液和待测样本。配制BCA工作液，将试剂A和试剂B按照50:1的比例混合均匀。向每孔中加入200μL的BCA工作液，轻轻混匀，避免产生气泡。将96孔板在37℃孵育30分钟，然后在酶标仪上测定562nm处的吸光度。根据标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度。
2. Bradford法准备标准蛋白溶液（如BSA，浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）和待测样本，同样每个样本设置3个复孔。在96孔板中，分别加入10μL的标准蛋白溶液和待测样本。向每孔中加入200μL的Bradford试剂，轻轻混匀。室温孵育5 - 10分钟，在酶标仪上测定595nm处的吸光度。根据标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度。（三）GPX4酶活性测定1. 在96孔板中设置空白对照孔、标准曲线孔和待测样本孔，每个样本设置3个复孔。

2. 空白对照孔：加入50μL的酶稀释缓冲液、50μL的PBS、10μL的100mM GSH溶液和10μL的10mM DTNB溶液，最后加入20μL的去离子水，总体积为140μL。

3. 标准曲线孔：分别加入不同浓度的GSH标准溶液（如0、2.5、5、10、20、40μM，用PBS稀释）50μL，再加入50μL的酶稀释缓冲液、10μL的10mM DTNB溶液，最后加入20μL的去离子水，总体积为140μL。

4. 待测样本孔：根据蛋白定量结果，将待测样本用酶稀释缓冲液稀释至合适的浓度，使反应体系中的蛋白含量在合适范围内（一般为1 - 10μg/孔）。加入50μL稀释后的待测样本、50μL的酶稀释缓冲液、10μL的100mM GSH溶液和10μL的10mM DTNB溶液，最后加入20μL的去离子水，总体积为140μL。

5. 轻轻混匀96孔板中的溶液，在37℃孵育5 - 10分钟，使反应体系达到平衡。

6. 向所有孔中加入10μL的20mM H₂O₂溶液，启动反应，立即在酶标仪上测定412nm处的吸光度，每隔30秒测定一次，连续测定5 - 10分钟。

（四）数据处理
1. 根据标准曲线计算出不同时间点反应体系中GSH的浓度变化。2. 以时间为横坐标，GSH浓度变化为纵坐标，绘制反应动力学曲线。3. 从反应动力学曲线中选取线性反应阶段，计算GSH的消耗速率（Δ[GSH]/Δt）。
4. 根据酶活性的定义，计算GPX4的酶活性。通常酶活性单位定义为每分钟催化1μmol GSH氧化所需的酶量（U/mg protein），计算公式为：GPX4酶活性（U/mg protein） = （Δ[GSH]/Δt）×反应总体积（mL）÷蛋白含量（mg）÷反应时间（min）。

五、注意事项1. 细胞或组织裂解时，要确保裂解充分，同时注意裂解液的用量和裂解时间，避免过度裂解导至蛋白降解或酶活性丧失。

2. 样本保存过程中，要避免反复冻融，因为冻融过程会破坏细胞结构和蛋白质的稳定性，导至酶活性下降。建议将样本分装成小份保存，每次使用时取一份，避免剩余样本再次冻融。
3. GSH、H₂O₂和DTNB等试剂对光和温度敏感，应避光保存，并在低温下存放。GSH和H₂O₂的工作液要现用现配，以保证其浓度的准确性和活性。
4. 酶稀释缓冲液中的甘油、BSA和蛋白酶抑制剂等成分对于维持酶的活性和稳定性至关重要，要按照正确的比例配制，并注意保存条件。