层析柱的柱效测定

balabala

  层析柱的柱效测定是在纯化实验中非常重要的步骤，也是我们得到准确结果的保证。如果您是自己装柱，建议您在使用前先做柱效测定来确定柱子的效果。另外，当层析柱使用过一定次数，或者发生实验结果异常，柱子进入气泡，超压等问题，我们也可以对柱子进行柱效测定来判断柱效是否正常。
一、柱效测定标准
Pulse test是目前最常用的测试方法，即使用少量的样品流经装填好的层析柱中，通过仪器上的检测器检测实验过程，实验结束后对洗脱峰进行分析。
柱效测定主要通过计算理论踏板高度（HETP）和对称性（As）来确定。

01、理论踏板高度
1952年，马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出踏板理论（Plate theory），把一根连续的层析柱设想成由许多小段组成，在每一小段内，假定样本可以在固定相和流动相中达到分配平衡，这样一个小段称为理论踏板，一个理论踏板的长度称为理论踏板高度。主要反映柱子的分离效果。

HETP判断标准：


HETP=L/N
HETP：理论踏板高度
L：柱床高度
N=5.54 x (Ve/W1/2)2
Ve：峰洗脱体积
W1/2：50%峰高位置的峰宽

一般来说，当HETP/填料粒径（dp）<=3时，认为柱效较高。
02、对称性
10%峰高处的前后半峰宽的比值，主要反映峰的对称性。

As判定标准：


As：峰对称性
As=b/a
b：10%峰高位置的后一半峰宽
a：10%峰高位置的前一半峰宽

一般来说，0.8 < As < 1.8时认为柱子装填效果比较好。

二、柱效测定方法



三、Unicorn软件操作
柱效测定可以通过Unicorn软件操作和自动计算。
在 Unicorn 软件中的「method editor」模块中，内置了柱效测定方法模板，即「column performance test」的程序模板，方法包含「equilibration」和「column performance test」两个阶段，利用简单填空的方式，将流速、上样体积等条件添加进去，就可以自动运行一个柱效测定的程序啦！


柱效测定实验完成后，我们需要利用 HETP 和 As 两个参数定量描述我们的装柱效果，在「Evaluation」模块中打开运行之后的结果，点击上方工具栏「Peak Integrate」图标，如下方红色方框所示，可以对峰进行积分。在积分表格旁的空白处，右击鼠标，选择「customize」选项，勾选「HETP」和「As」，结果就会出现在积分表格中。


Cytiva蛋白纯化促销仍在火热进行中，有需要的老师请联系您身边的优宁维销售！

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/333505091