PNAS∣材料合成的微生物的定向进化

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PNAS∣材料合成的微生物的定向进化
文献信息：



作者：Julie M. Laurent, Ankit Jain, Anton Kan, Mathias Steinacher, Nadia Enrriquez Casimiro, Stavros Stavrakis, Andrew J. deMello, André R. Studart
接收时间：June 20, 2024
https://doi.org/10.1073/pnas.2403585121
PNAS影响因子：11.205

背景介绍













自然界中存在着众多能够创造材料的微生物，这为可持续制造提供了一种极具潜力的方法。然而，微生物生产材料的过程通常较为缓慢，且合成生物学工具的应用受限于对基因型与表型联系的了解程度，仅在已知相关联系的情况下，才能设计出更高效的微生物。
在本研究中，研究者们利用高通量定向进化平台，通过施加选择压力，增强了整个微生物的适应性，并成功识别出能够提升原始物种材料生产能力的遗传途径。以Komagataeibacter sucrofermentans作为模型微生物，研究展示了基于滴液的微流控平台能够实现对纤维素过量生产者的定向进化，从最初的40,000个随机突变体中筛选出少数具有高产纤维素能力的菌株。对这些进化菌株进行测序后，揭示了细菌的纤维素形成能力与编码细胞内蛋白质周转的蛋白酶复合体的基因之间存在意外的联系。这一发现不仅展示了高通量定向进化平台在增强微生物特定表型适应性方面的强大能力，还为解开基因型与表型之间的复杂联系提供了新的思路和方法，为可持续材料制造领域带来了新的突破和希望。




图文解读









图 1. 纤维素生产微生物的直接进化以增强生物制造
%28A%29原始的K. sucrofermentans代谢糖为 UDP-葡萄糖，后者被纤维素合酶跨膜复合体催化聚合为 β%281 到 4%29 葡聚糖链。葡聚糖链通过细胞壁外排，并自我组装成束以形成纤维素纳米纤维。在自然环境中，这种纤维素纤维的产生有助于细菌抵御紫外线辐射和恶劣的化学环境，同时在液体培养中帮助细菌浮到气-水界面以获取更多氧气。
%28B%29提出了研究的核心假设，即在特定的选择压力下，微生物产生更多的纤维素，这可能是由于其基因组中的突变，提高纤维素的生产速度。
%28C%29展望了通过结合进化细菌的自下而上的纤维素生产能力与自上而下的成型方法（如铸造、模塑和3D打印），有望制造出具有独特多尺度结构的生物材料。
%28D%29描述了定向进化过程的起始步骤，即通过全基因组突变方法创建一个突变体库，而不是仅在编码特定目标蛋白的基因中引入突变，目的是在微生物的整个基因组中探索，以产生具有期望纤维素合成表型的变体。
%28E-G%29详细说明了利用滴液微流控平台进行定向进化的循环过程。包括将单个细菌封装在滴液中（图1E），在滴液中孵化以进行纤维素生产和细胞生长（图1F），以及通过高速荧光激活滴液排序（FADS）筛选出纤维素过量生产的突变体（图1G）。这一过程的关键在于单个细菌在滴液中的封装，它建立了基因型和表型之间的直接联系。




图 2. 突变体库的创建、单细胞包封和滴液中的纤维素定量
%28A-C%29展示了通过紫外线C（UV-C）照射创建突变体库的过程。研究了不同UV-C剂量对细胞存活率的影响，发现10 mJ/cm²的剂量在保持细菌活性的同时能够产生高比例的突变体。经过50小时的恢复培养，突变细菌的浓度显著增加。
%28D-E%29介绍了使用微流控装置将突变体和原生细菌封装在49微米滴液中的过程。通过调整细菌悬浮液的浓度，使得大约90.5%的滴液为空，9.0%包含单个细胞，0.5%包含多个细胞，从而确保了细胞负载的滴液几乎只包含单一基因组，将基因型与表型紧密耦合。
%28F-I%29描述了利用荧光增白剂28（FB）量化封装细菌产生的纤维素的方法。通过共聚焦显微镜成像，观察到细菌在滴液中孵化6小时后就开始产生纤维素，24小时后纤维素占据了大部分滴液体积。通过图像分析得到的荧光分布直方图清晰地显示了孵化6小时和24小时后出现的含纤维素滴液群体，验证了基于荧光的量化方法的有效性。



图 3. 荧光激活滴液分选及进化菌株的培养
%28A%29描述滴液分选过程的示意图。经过 24 小时培养后，含细胞（和空）的滴液通过激光，激发纤维素结合的荧光染料。如果 PMT 探测器记录到的电压高于用户定义的阈值，则相应的滴液通过介电电泳分选。
%28B%29显示微流控分选器在工作中的图像，直观地呈现了滴液排序的实际操作过程。。%28比例尺：100 μm.%29
%28C%29呈现了含突变细胞的滴液在孵化24小时后的纤维素荧光信号直方图。通过设置PMT电压阈值为2.75V，成功筛选出了最荧光的1.25%的突变体。
%28D%29展示了经过排序后收集的含进化细菌的滴液在固体培养基上培养出的菌落。随机挑选了五个进化细菌菌落（Ev1至Ev5）进行进一步分析。



图 4. 进化菌株的纤维素生产能力
%28A%29描述了用于形成块状材料的BC菌膜的培养过程。从单个菌落开始，在液体培养基中培养进化、原生和对照微生物，以在静态条件下在气-水界面生长BC菌膜。
%28B%29通过视觉检查，可以看出进化细菌产生的菌膜比原生菌种更厚。
%28C%29扫描电子显微镜图像显示了由进化菌株合成的纤维素纤维的典型交织微观结构。
%28D%29通过重量测量和热重分析（TGA）比较了不同变体产生的纤维素量。结果显示，四个进化菌株产生的纤维素比原生细菌多出54%到70%。
%28E%29展示了在滴液中分析原生、对照和进化细菌的荧光强度分布直方图。进化突变体在滴液中的纤维素生产能力明显优于原生和对照细菌，其荧光强度分布强烈偏向高荧光值。



图 5. 基因组分析和基因-性状联系的机制验证
%28A%29展示了原生菌株的基因组表示，与原生细菌相比，进化菌株Ev2至Ev5在clpA基因中显示出一个12个碱基对的缺失，该基因编码蛋白酶复合体ClpAPS的一个重要结合域。
%28B%29在蛋白质水平上，基因组缺失转化为ClpA中四个氨基酸的缺失，位于ClpS的结合位点。研究假设这种缺失限制了ClpS-ClpA的相互作用，从而促进了进化细菌的纤维素生产增加。
%28C%29通过TGA和秤重测量比较了原生、进化（Ev5）和ΔclpS敲除菌株在单个菌落孵化12天后产生的BC菌膜的纤维素产量。结果显示，与原生菌株相比，对照、进化5和ΔclpS敲除菌株的纤维素产量分别高出26%、66%和25%。
%28D%29展示了不同菌株在含有2%体积比纤维素酶的摇动条件下的细菌生长曲线。阴影区域代表标准差，表明对照、进化和ΔclpS菌株的生长速率均快于原生菌株。
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