蛋白纯化层析柱装柱总结：装柱与柱效测定方法

虎威将军

—————— 装柱方法 ——————
许多装柱模式与方法可用，常用的方法为恒定流速，恒定压力，吸力（suction），在位装柱(pack-in-place)和轴向压缩(Axial Compression)。总的来说，所有的层析柱都可以用恒流或者恒压方法进行装柱。如果制造商未提供装柱方法，推荐使用恒流或者恒压方法进行装柱。
在恒流或者恒压装柱法中，在层析空柱内的填料胶浆在液体流动下从顶端沉积到底端。最好的方法是两步法，第一步低流速下（如最大流速的30%）形成固态均一的床柱，之后，第二步此床柱以合适的压缩因子（Compression factor）在高流速下压缩，如最大流速的80%或者最大压力的80%所对应的流速。
80%是最大的操作流速，然而真实流速可能低于这个值，造成流速减低的原因主要有样品或者溶液的高粘性（Viscosity）。通常，在低温下进行层析，液体粘性增加）。
在吸力法中，胶浆被位于层析柱外部的泵所装填。通常地，这些层析柱使用装柱器以盛放全部体积的胶浆。吸力法仅适用于需要在装柱过程中压力降较小的柔软填料。在位装柱法利用插入层析柱内的喷嘴进行装柱，从而允许在封闭系统内将填料泵入层析柱内。在位装柱法的主要优势在自动化、速度和重复性。当使用在位装柱法对固定端部的层析柱进行装柱时，胶浆以高速的状态进入，多余的液体被从出口排出以形成床柱并压缩。
—————— 柱效测定 ——————
对装好的层析柱进行测试以检验其是否有效装填，这十分重要。应定期重复柱效测定，以确保柱效的一致性及床柱的完整性。测试条件十分重要，因为糟糕的测试会把装填很好的层析柱排在外（英文表达如此，翻译起来有点费劲，意译的话，就是测试过程烂，会将一个装的好的柱子拒之千里）。需特别关注对特性的定义，以及这些特性所对应的的分离性能，例如，一个用于分步洗脱的捕获阶段层析柱就不需拥有和精纯阶段线性洗脱的层析柱相同的特性。但是，如果已测得效值明显下降（效率，对称性或压力降），则预示着层析柱的性能变差，应考虑重新装填。影响柱效的主要因素有：填料颗粒尺寸，装柱质量，流速，样品体积和粘性。
最常用的柱效测定方法为Step法和Pusle法
Step法中，缓冲液盐分逐渐变化，该方法主要对工业层析过程比较重要。在此重点介绍脉冲法。
Pulse法
最常用的柱效测定方法，即产生一个狭窄的样品峰，依次评估峰增宽和峰的对称性。这两个指标分别称为HETP（Height equivalent to a Theoretical Plate）和As( Asymmetry factor)。
传统上，氯化钠，苯甲醇或者丙酮被用来测试柱效。氯化钠用电导监测，而后两者使用UV监测。
丙酮使用水作为流动相，考虑到丙酮可能与聚合物的柱材料有相互作用，100%的乙醇作为流动相更佳，但这只有在某公司进行有机溶剂相关实验，或者不计成本时才使用的。氯化钠作为样品时，浓度为0.8M，使用0.4M的氯化钠溶液作为流动相。
样品上样体积为：柱体积的1%。
HETP数值，不同的层析柱类型所要求的不一样。关于此数值，另开其他篇幅阐述。


As数值：理论上，越接近1越好。现实中，0.8-1.8之间是可接受的。
当As<1时，即a>b，即出现leading峰，通常表明装柱过紧，床柱内形成了Channeling。当As>1时，即a<b，这种情况更为常见，Tailing峰，多是因为压力不足，分散筛网下方有空气，或者筛网或填料部分堵塞。
参考文献：

• Handbook of Process Chromatography. 2nd Edition.Lars Hagel,Gunter Jagschies,Gail Sofer,Academic Press,2008
  
• Column efficiency test.GE Healthcare, Application note,28-9372-07-AA，2010
  

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/672870996