流式课堂 | 流式的基本原理

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流式细胞术（flow cytometer，FCM）广泛应用于临床医学和基础医学。集物理电子技术，激光技术、计算机技术为一体的新型高科技仪器。分为流式分析和流式分选两种仪器。工作原理是将细胞或其它生物颗粒（现已达到分泌囊泡的大小）呈直线状泵入分析或分选系统，从而达到对细胞进行逐个、多参数的分析或分选目的。包括液流系统、光学系统、信号接收系统和分析系统四大模块，分选的仪器还包括分选系统。
重要的专业术语
1、前向散射（FSC）与侧向散射(SSC)
前向散射和侧向散射与细胞的固有属性有关，通常称为物理属性。前向散射（FSC）也称小角散射，即激光、细胞和信号接收器成180度。与细胞的直径成直线关系。侧向散射也称90度散射，即激光、细胞和信号接收器成90度，与细胞内颗粒结构成近似直线关系。细胞内颗粒结构越复杂，该值就越大。反之也就越小。（见下图）





前向散射（FSC）与侧向散射（图片来自流式细胞术基本原理与实用技术）

2、荧光信号：脉冲面积、宽度和高度
经过特定标记荧光的细胞在激光的照射下，荧光染料吸收能量发生跃迁，会发出荧光，产生的荧光被信号接收系统捕获，形成信号脉冲，即荧光信号。每一个信号脉冲都有其高度、面积与宽度。其中脉冲面积是采用积分计算的荧光通量，表示接收到荧光信号的总强度，通常用A表示；脉冲高度表示荧光信号的瞬时强度，用H表示；脉冲宽度表示检测荧光信号所需的时间，用W来表示，常用来区分粘连体的细胞（不同实验，不同仪器，区分粘连体的方式不同）。



（图片来自流式细胞术基本原理与实用技术）

流式细胞术的工作原理
流式细胞术可以定量检测样品中单个细胞的物理化学特征，定量分析接收到的激光照射到细胞后的散射光信号和荧光信号。细胞经过荧光标记（可以是染料直标，也可以染料标记的抗体标记细胞），被激光照射激发后发出荧光信号，从而得到特定的细胞状态或细胞表达特定抗原分子强弱的化学特征，并通过散射光照射得到与细胞体积和颗粒度相关的物理学特征，通过这两种特征对细胞实现分析和分群。
细胞流式上机的操作步骤：
a) 取材
b) 单细胞悬液的制备（组织样本）
c) 细胞诱导（选做，有些免疫细胞需要特殊的诱导因子刺激）
d) 荧光标记（分表面胞膜标记和胞内标记）
e) 流式上机
f) 流式分析or分选
流式细胞术的基本功能与应用
定性、定量分析细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分，还可以对细胞各功能进行检测，如：细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、氧化还原状态、线粒体膜电位等。目前还有流式质谱仪和纳米级流式仪，将流式仪的功能和应用推向了又一个高度。
具有分选功能的流式细胞仪，可通过标记，将具有特定亚群的细胞从混合细胞群中分选出来，再进行后续的培养或处理等，实现特定亚型的细胞分析。
案例分析见《流式课堂 | 人外周血调节性T细胞鉴定方案》

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