流式细胞仪——流式细胞术的强大广泛应用及科普

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流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球，细菌，小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。作为应用流式细胞术进行检测的技术平台，现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟，并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及 临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。
那么对于如此强大，而又涵盖范围如此之广的检测技术，具体可以进行哪些检测，应用到哪些实验呢? 今天，小编就为大家——道来。
一、流式细胞术之细跑凋亡检测：
细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制，它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。
细胞凋亡的早期阶段还涉及磷脂酰丝氨酸(PS) 从细胞膜内部到外层的易位，使其暴露于细胞外环境。在细胞凋亡的晚期阶段，细胞膜变得可渗透，从而影响其完整性和材料的选择性运输。膜联蛋白V等流式细胞仪试剂可用于结合暴露在细胞膜上的PS，从而标记早期凋亡细胞，而DNA 结合染料7-AAD/PI 则可用于标记晚期凋亡细胞。
细胞凋亡常用试剂：Annexin-V&PI双染或者Annexin-V&7-AAD双染。
二、流式细胞术之细跑周期检测：
正常的人体细胞是含有恒定数量DNA的二倍体。在细胞分裂的过程中，DNA合成导致总DNA含量翻倍，随后在有丝分裂后恢复正常的DNA含量。利用流式细胞仪，可以进行详细的细胞周期分析，了解肿瘤细胞分化、细胞转化以及细胞与化合物之间的相互作用。


三、流式细胞术之免疫表型分析：
免疫状态与疾病状态、治疗效率以及对疫苗等外部刺激的反应有关。免疫表型分析可快速识别候选细胞类型、亚类和功能。由于免疫细胞可能影响疫苗的免疫原性及其效能，因此监测多种免疫细胞群的频率以及特定细胞亚群(如单核细胞、NK细胞、T细胞和B细胞)的分化或活化状态至关重要。流式细胞仪可同时定量分析多种白细胞，以便更好地了解患者的免疫状态并监测机体对传染病的免疫反应。


流式细胞术是用于分析高度异质性细胞(例如血液中的免疫细胞)，从而鉴定目标细胞群的强大工具。在适应性免疫应答中，T细胞被活化后，迅速进行分裂并消除被感染或癌变的细胞。免疫检查点抑制剂能够通过阻断作用逆转抑制性受体的表达，恢复T细胞的功能，改善抗肿瘤免疫功能，因此T细胞抑制性受体的检测成为了癌症免疫治疗研究的热点。然而，单独分析T细胞抑制性受体的表达并不能全面了解T细胞的状态。检测其他过程(T细胞分化、活化、既往抗原暴露、脱颗粒和细胞因子产生)的标志物，可以提供更全面的信息。
四、流式细胞术之细跑因子检测：
细胞因子是免疫细胞对病原体、自身免疫或治疗药物的激活反应所必需的小分子。细胞因子的信号传导可以调节基因调控、先天免疫反应和适应性免疫反应以及炎症。因此，测量细胞因子产生并确定细胞因子产生的来源对于深入了解免疫反应非常重要。基于微球的流式细胞术检测是测量细胞因子的高效方法，可以使用具有不同荧光强度的混合微球来测量单个样品中的多种可溶性分析物。
检测细胞因子目前主要有多种方法：包括ELISA法、胞内染色法(intracellular staining assay)、Legendplex多因子检测、Luminex、CBA法，后4种就是利用流式细胞术的方法检测细胞因子。
五、流式细胞术之细跑活性氧(ROS)检测：
CM-H2DCFDA在细胞内水解成DCFH,DCFH被胞内的氧化剂氧化成高荧 光 强 度的DCF,用于 检 测ROS的 生 成。Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)是非极性的化学物质能自由通透细胞膜。进入细胞后，被easterase去掉两个乙基，形成具有极性的2',7'-dichlorodihydrofluorescein(DCFH),保留在细胞内。当细胞 产生H2O2与DCFH反应，使DCFH形 成了2,7'-dichlorodihydrofluorescein(DCF)，通过流式细胞仪测定细胞内DCF的荧光强度，即可对单个细胞为基础的细胞内ROS进行原位实时检测，从而根据荧光强度直接反映细胞内自由基的变化程度。
六、流式细胞术之线粒体膜电位(JC-1)检测：
MMP(Mitochondrial membrane potential)是线粒体膜电位，线粒体是动植物细胞生成ATP的主要地点，是促进细胞能量转换、参与细胞凋亡的重要细胞器。线粒体在产生能量时会将电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧，若质子及其他离子浓度的不对称分布就会形成线粒体膜电位，即MMP。
JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membranepotential)的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates),可以产生红色荧光：在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer),可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
七、流式细胞术之其他相关检测：
除上述6种检测内容之外，强大的流式细胞术还有其他多方面的检测，如细胞增殖检测、细胞内钙离子浓度检测、细胞毒性分析与检测、细胞融合检测、血小板凝聚率检测、植物倍体分析等。



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