免疫共沉淀（CO-IP）技术原理、对照设置与实验流程

风云

蛋白质是细胞活性及功能的最终执行者，而蛋白质-蛋白质之间的相互作用是蛋白质发挥功能的重要途径。迄今已发展了多种研究方法为蛋白质相互作用的研究提供了有效的分析途径，免疫共沉淀就是其中一种较为常用的方法。
免疫共沉淀技术原理

利用非变性剂裂解完整细胞，细胞内许多蛋白质间的相互作用可以保持下来，这样便可以用于检测蛋白质之间的相互作用。如果蛋白质X用其抗体免疫沉淀，则在细胞内与X稳定结合的蛋白质Y也能沉淀下来。蛋白质Y的沉淀是基于与X的物理性相互作用，被称为免疫共沉淀。


免疫共沉淀常用于融合表达的带有蛋白标签的特异性抗体与目标蛋白质或蛋白复合物结合，形成蛋白复合物沉淀。将蛋白质复合物溶解，再通过对蛋白标签具有特异吸附作用的亲和色谱柱将蛋白复合物分离纯化出来，进而通过电泳，SDS-PAGE或质谱等技术鉴定分离得到的蛋白。该方法常用来确定生理条件下目的蛋白在细胞或组织内是否存在与其相互作用的蛋白质（未知蛋白），也可以应用于验证两个已知相互作用的蛋白质。
免疫共沉淀技术的特点

免疫共沉淀法所研究的相互作用蛋白均是在宿主体内经翻译后修饰的天然蛋白，可以真实反映正常生理条件下蛋白质间的相互作用。由于抗原抗体的相互作用是在生理条件下检测的，所以有过量表达引起的假阳性可以排除。但该方法需首先针对目标蛋白，制备出一定量的多克隆或单克隆抗体，过程比较复杂。同时，免疫共沉淀的灵敏度不高，这是由于抗原浓度低于亲和层析中的蛋白质浓度造成的，目的蛋白质只有达到一定浓度才能与抗体结合形成沉淀。因此该法只适用于研究具有高表达量的目标蛋白，但是表达量过高，会破坏相互作用的天然状态，所以应用范围有较大局限。利用该方法检测蛋白质之间的相互作用要求在一系列的清洗过程中保持复合体不变，因而该方法可能检测不到细胞中处于动态平衡中的低亲和与瞬间的相互作用，而且仅应用于从细胞中溶解出来后仍存在于生理复合体中的蛋白质。因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要。
免疫共沉淀的对照设置

为了确保最终得到的结果是天然状态下的相互作用，而不是假阳性，在Co-IP的实验设计过程中，需要设置正确的对照。假设Co-IP实验的实验组为“磁珠+抗X抗体+蛋白X+蛋白Y”，则可能出现的假阳性及对应需要设置的实验对照如下表所示：

可能出现的“假阳性”	需要设置的对照实验
磁珠与蛋白X非特异性结合	磁珠+抗体X+抗体Y
磁珠与蛋白Y非特异性结合	磁珠+蛋白Y
抗X抗体和Y非特异性结合	磁珠+抗体X+蛋白Y
抗X抗体（或磁珠）会和细胞裂解液内其它蛋白结合	磁珠+抗体X+未转染质粒的宿主细胞裂解液
抗体的非特异性结合	Normal lgG+蛋白X+蛋白Y

除此之外CO-IP实验还会设置一个阳性对照组（Input组），Input组为直接利用抗体X（抗体Y）对细胞裂解液进行WB检测，验证细胞裂解液中存在蛋白X(抗体Y)。在某些CO-IP实验中，实验人员会把IP后的上清分别进行蛋白X和蛋白Y的WB检测，该对照组称为output组。
免疫共沉淀的实验流程

免疫共沉淀实验流程为：收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE分离蛋白—WB检测是否存在靶蛋白。详细实验操作流程。
免疫共沉淀结果的真实性

验证免疫共沉淀试验结果的真实性主要从下面几点考虑：（1）抗原的沉淀是由本身抗体的结合引起的，单克隆抗体不存在此问题，故建议使用单克隆抗体。（2）确保抗体的特异性，就是在不表达抗原的细胞溶解物中加入抗体也不会出现共沉淀现象。（3）相互作用是真实的体内过程，而不是细胞裂解的结果。
免疫共沉淀结果的意义

利用内源性CO-IP实验为验证两个蛋白是否存在已知作用，如果最终的结果为阳性，则可以证明两个蛋白之间存在相互作用；但如果结果为阴性，无法证明两个蛋白之间不存在相互作用，也有可能是蛋白在细胞内表达量低等原因导致。因此在进行内源性CO-IP验证两个蛋白是否存在相互作用时，建议先做过表达CO-IP作为对照。
<hr/>德泰生物提供免疫共沉淀CO-IP检测服务，可对两种已知蛋白是否存在相互作用进行验证，也可以验证在总蛋白中是否含有与已知蛋白相互作用的未知蛋白。通过SDS-PAGE银染，结合Western Blot及液相质谱等对两种蛋白之间是否存在相互作用进行定性分析。

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