氨苄筛选为什么不靠谱？

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做分子生物的同学肯定对氨苄西林（Ampicillin）并不陌生。在大肠杆菌及其他细菌中进行基因克隆与蛋白表达的时候，这种广谱抗生素是最常用的选择标记之一。
为了保证实验的成功，在注意操作的同时，大家有没有怀疑过自己使用的那些所谓靠谱的技术呢？就比如氨苄西林筛选。很多人循规蹈矩地做着这个实验，但发现质粒里往往没有自己的目标序列，或是产量很低。很有可能是你的选择标记已经失效了！
通过这篇文章，小编会给大家讲讲氨苄筛选的工作原理和实验技巧，让你在表达蛋白的时候有个更好的开端。


首先，让我们简单的了解一下氨苄筛选的基本原理。氨苄西林是一种广谱抗生素（结构如上图所示），可以杀死多种革兰氏阴性菌或是阳性菌。但是它也有自己怕的东西，那就是β-内酰胺酶（β-lactamase）。这种酶可以将氨苄结构中的四元内酰胺环β-内酰胺（β-lactam）水解，使其失去药性。基于这一特点，经过特殊设计的质粒都携带bla基因。转化成功的细菌会携带这种基因，从而表达β-内酰胺酶，在有氨苄西林的环境下生存下来。
但是现在问题来了：细菌产生的β-内酰胺酶是会分泌到细胞外的。随着细菌的生长，培养基中的β-内酰胺酶会不断增加，这时培养基内氨苄西林会被降解，浓度降低。筛选压力一旦消失或是变弱， 不带有抗性质粒的细菌，就有了可乘之机。
不知道大家在实验过程中是否会遇到过卫星菌落的现象？琼脂板培养时间过长时，会发现一个大菌落的周围会出现一些小的卫星菌落。卫星菌落是如何形成的呢？这是因为阳性克隆分泌了β-内酰胺酶，并在其周围积累聚集，降解了这个区域的抗生素，因此没有此质粒的小菌群则环绕而生。


使用氨苄青霉素会产生的另一个问题是质粒丢失。细菌在传代的时候，会出现质粒丢失，传代次数越多，质粒丢失的可能性越大。对于其他抗生素如氯霉素，细菌如果丢失了部分带抗性的质粒，该菌在含有氯霉素的培养基中是不会生长的。但是对于氨苄则不然，在液体培养液中，培养时间过长的培养基中抗生素的浓度会降低，丢失了一部分质粒的细菌也可以在其中生长。
因此对于使用氨苄作为抗性标记的克隆，每隔一段时间需要检查细菌质粒丢失情况。比较直观的办法就是通过SDS-PAGE，如果发现蛋白质的表达水平降低了，很大可能是因为质粒丢失了。这时候需要重新转化重组载体。
说了这些缺点之后，大家是不是有点灰心了。小编根据自己的实验经验和网上信息，总结了以下几个方法，来克服氨苄筛选的缺点，希望能帮助到大家！如果你有更好的办法，也欢迎评论分享你的经验。

• 在液体培养中，不要让细胞长到饱和，在LB培养基内，OD600绝对不能超过3；
  
• 如果是扩大培养，可以先把初始培养液内细胞沉淀，然后利用新鲜的培养液重悬，再进行下一步的培养，这样可以大大减少β-内酰胺酶在液体中的含量；
  
• 使用高浓度的氨苄西林，例如 200µg/mL; 这样β-内酰胺酶很难分解掉所有的氨苄西林，对预防卫星菌落很有效；
  
• 不要使用配制时间过长的氨苄溶液。氨苄存储时间过长或者保存不当，很有可能发生降解。建议新配制的溶液分装保存，减少冻融的次数；
  
• 如果还是不行的话，就试试羧苄青霉素（Carbenicillin）。这个和氨苄筛选的工作原理很像，分解的速度相较于氨苄西林更慢，但也更贵。
  

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