流式细胞术的学习（四）-基本操作和技巧

幸福侠侣

样品制备：分析检测对象为细胞或细胞样颗粒性物质，流式检测要求样品新鲜，液氮冷冻保存或固定处理后的样品不能用。
悬浮细胞：直接收集于离心管中，离心沉淀细胞，用PBS重悬沉淀，取适量细胞于Eppendorf离心管中，标记相应的荧光素偶联抗体，洗去未结合的抗体，用流式PBS重悬细胞于流式管中，就可上样分析样品细胞。
贴壁细胞：胰酶消化细胞适当时间后，用培养基或PBS反复吹打，收集待测样品细胞，离心后标记荧光素偶联抗体即可。
外周血单个核细胞（PBMC）：主要包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，不包括中性粒细胞，常用到的提取方法是Ficoll-hypague密度梯度离心法。中性粒细胞的外周血白细胞，采取直接用红细胞裂解液裂解红细胞，多次低速离心去除红细胞碎片即可。
流式细胞仪接收到的荧光信号来源于结合在样品细胞上的荧光素，荧光素偶联抗体或者荧光染料与细胞结合后就会使细胞带有相应的荧光素，该荧光素被特定波长的激光激发后产生特定波长范围的荧光，分析该荧光信号的强弱就可以间接反映样品细胞的某些特征。
荧光素产生荧光的原理：荧光素在未被激发时外层电子处于基态，当被特定波长的激光激发后，外层电子接收到足够的能量就会跃迁到激发态，处于激发态的荧光素外层电子不稳定，会自发从激发态回到基态，同时释放出特定波长的荧光。
流式分析时可以同时标记发射不同波长荧光的荧光素，被激发后发射的荧光被不同的荧光通道接收，它们之间的信号采集和分析不会互相干扰。





常用流式荧光素表

*PerCP和PE-Cy5不能同时使用这两种荧光素偶联的抗体，因为这两种荧光信号是被同一个荧光通道接收的。
FL1接收FITC的荧光信号，FL2接收PE的荧光信号，FL3接收PerCP或PE-Cy5的荧光信号，FL4接收APC的荧光信号。
FITC是最常用的荧光素，较稳定，在阴暗干燥处能够保存多年，与FITC偶联的流式抗体种类也最多；
PE荧光素的荧光信号较强，适用于弱表达的抗原分子的分析；
PE-Cy5是由PE和Cy5两个荧光素连接而成的，488nm激光能激发两个荧光素发射的荧光，此为荧光共振能量转移。
APC荧光信号也很强，适用于弱表达的抗原分子的分析，只能由635nm红激光器激发，不能由488nm激光器激发。
PE-TxRed、PE-Cy7和APC-Cy7荧光素不常用，一般只能在更多荧光通道的流式细胞仪上使用。
CFSE和PKH26荧光素是单独使用，不与抗体偶联；CFSE能够与细胞膜上和细胞内的蛋白质非特异性结合，PKH26能够嵌入细胞膜的双分子层中，用于细胞示踪和检测细胞增殖等；
Hoechst33342可标记活细胞，多用于分选侧群干细胞；
PI荧光素用于检测细胞的DNA含量，可用于细胞周期检测，也可用于区分活细胞和死细胞。
7-AAD用于标记死细胞，在需要明确区分活细胞和死细胞时使用；
TMRE可以通过指示线粒体膜电位的变化检测细胞凋亡；
FAM在水中稳定，主要用于DNA自动测序，也可用于PCR产物定量和核酸探针等；
Fluo4是化学荧光钙离子指示剂，常用于游离的钙离子水平；
SNARF-AM对细胞内pH敏感，可用于流式检测细胞内pH，被488nm激光激发后能够发射640nm和575nm左右的两种荧光。

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