影响组织处理的关键脱水步骤是哪几个？

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影响组织处理的关键脱水步骤是哪几个？
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长长的路

组织脱水是病理制片很重要的一环，间接影响到后面的染色结果，因为现在多数是全封闭式脱水机脱水，所以脱水环节往往容易被忽视，今天咱们就聊一聊脱水那些事儿。




01
原理

组织在固定液长时间浸泡后，会含大量的水分，为了制片和长时间保存，必须将水分置换成石蜡。
水和石蜡是不相溶的，水也不溶于二甲苯，但水溶于乙醇，乙醇和石蜡都可以溶于二甲苯，所以利用乙醇和二甲苯作为媒介，最终将组织中的水分替换成石蜡。
02
流程

明白了原理，那流程就简单了，自然是依次浸入乙醇、二甲苯、石蜡了。
但组织突然进入高浓度乙醇会发生收缩和变形，不利后续包埋、切片、染色，所以乙醇要从低浓度到高浓度依次进行，且不要在高浓度时间过久。研究表明乙醇脱水能力在60%-95%浓度之间是相对稳定，低于60%的乙醇脱水能力下降明显，初始乙醇浓度低于50%，会很快失去脱水效应。


因水分被溶剂（如二甲苯）取代，二甲苯与玻璃的折光率非常接近，都是1.5左右，我们用光学显微镜观察，感觉组织块变得透亮，因此称之为透明。
最后是浸蜡，温度为刚刚超过石蜡熔点为宜，熔点58-60°的石蜡，蜡缸温度设置62°为宜，太高可能会烫坏组织。
附上我整理的各大医院病理科脱水条件，虽然脱水机不一样，梯度乙醇浓度也有差异，但结果都很美丽，大多都是低浓度乙醇时间久，高浓度乙醇时间短；二甲苯1时间长，二甲苯2时间短；石蜡1时间短，石蜡3时间长。




03
关于脱水机

我司用的是徕卡ASP300S，整体体验不错，操作简单，脱水效果也不错，很稳定，美中不足的是一个脱水缸，大小组织需要分成2次脱水。
但徕卡已经有了2缸脱水机HistoCore PEGASUS，大小组织分开脱水，节约时间和精力，还是很不错的，就是价格也很美丽。
04
关于试剂更换周期



根据重庆人民医院刘瑾老师研究，第一缸７５％ 的乙醇每次脱水后下降２°，１９ 次后第一缸乙醇只有５０°，他每次脱水59个组织，大约1121个组织后，更换第一缸75%乙醇，后面的下移替换。
从第１０ 次检测开始，出现乙醇浓度下降，因此调整脱水时间，把第１缸７５％ 乙醇减少３０ｍｉｎ，把第２ 缸７５％ 增加３０ｍｉｎ，同时在第１ 缸１００％ 乙醇（脱水的倒数 第 二 缸）增 加 ２０ ｍｉｎ，通 过 这 种 时间的调整，组织脱水取得了很好的效果。
所以可以在脱水机设置一个常规程序，一个是脱600个组织后的程序，更改下在不同梯度乙醇中的时间。
当然刘老师的结果也是他那个条件下的试验，具体还要就结合各自的设备、试剂等实际条件来设定程序。
我下载了30多篇参考文献，需要的也可以加文末微信索取。
05
关于脑组织脱水

根据资料得知.脑组织中含有大量的磷脂和水,其中磷脂是由含有甘油的脑磷脂和一些不含甘油的神经磷脂组成的。脑磷脂的合成是由甘油三酯的重要中间产物磷脂酸水解为甘油二酯.其为脑磷脂的合成提供脂防酸和甘油部分丝胺酸脱鞍后生成乙醇胺。乙醇胺和胆碱参与脑磷脂合成前先活化成CDP-乙醇胺.然后合成脑磷脂。脑磷脂在其合成.分解的整个生化活动中伴随有大量的能量的转变和交换(ATP/ADP)，在所有这些生化反应过程中需要大量的水作为媒体环境.故脑组织总含水量大大高于其它组织。再者脑磷脂合成和分解都需要酶的作用.而这部分水分子在静态时与脑磷脂的结合比较牢固。
针对脑组织这一特性，在低浓度酒精的时间要适当延长1-2小时，可以为脑组织单独设置一个脱水程序。
但最重要的还是固定，脑组织最佳固定方式是灌注固定，不想灌注的要把脑子剪成3-4份再固定。
灌注固定可以参考徐一菲-北京中医药大学-《不同灌注方法及灌注量对大鼠脑组织及神经元固定的影响》结果，注射器+剪右心耳在耗时耗液较少的情况下能够较好固定脑组织。
具体操作：
剪肝组：提前准备好装有生理盐水和 4%多聚甲醛的 50 ml 注射器，左手捏持心脏，右手持剪刀在心尖处剪一小口，将灌注针插入左心室并向上推送至升主动脉，止血钳固定，并打开腹腔结扎腹主动脉。剪碎肝脏，先用生理盐水灌注，当肝脏颜色变白或变褐色，即可更换 4%多聚甲醛，待大鼠老鼠头后仰， 前肢剧烈抽动；前肢及颈部僵硬时，表明灌注固定完成。
实验组:其他方法同剪肝组，从心尖处插入灌注针后，结扎腹主动脉，剪破右心耳，先用生理盐水灌注，当从右心耳流出澄清液体时，即可更换 4%多聚甲醛，待大鼠头后仰，前肢剧烈抽动；前肢及颈部僵硬时，表明灌注固定完成。
06
注意事项

• 取材一定不要太厚，最理想是2cmX2cmX3mm大小，固定不好，也会影响脱水及后续染色；
  
• 乙醇和二甲苯不要同时更换，防止组织变脆；
  
• 乙醇作为最常用的脱水剂，脱水能力较强，对组织有较明显的收缩作用，为避免过度收缩导致后面乙醇无法浸到组织内部，故起始浓度最好为７０％ 乙醇水溶液，随后是９５％ 乙醇和无水乙醇。
  
• 我们在实践中发现组织在95％酒精中时间长 有 利 于 组织脱水，但要控制组织在纯酒精中的停留时间，以每道1～2小时为佳，组织不易收缩变硬。
  
• 我们在工作中体会到，在固定、 脱水及透明过程中设定的温度参数大于35℃极易引起组织变硬和收缩现象。因此所设的温度参数一般为35℃以下。
  
• 除脱水外固定后水洗也是影响切片质量的一个重要因素，水洗不够彻底‚容易造成脱片和染色不鲜‚对于需做免疫组化的组织‚由于固定后残余的福尔马林不利于组织内抗原的保存‚因此充分水洗尤为重要。初始程序为机洗0.5h并且设置一定时间轮换使液体中积存大量福尔马林从根本上说并未达到冲洗的目的；而新程序则改为流水冲洗0.5h‚不仅保证每次清洗都是新鲜清水，而且流水的冲刷力能更好的去除福尔马林溶液。
  
• 二甲苯致癌，更换实验人员注意做好防护，在通风橱内更换。
  

以上就是小诺关于组织脱水的一些经验分享，欢迎加下图微信交流，一起学习，共同进步！
当然，看完如果有收获，也欢迎关注转发，我是小诺，一个讲干货的实验员！咱们下期见！
参考文献
自动组织脱水机乙醇浓度变化对脱水的影响及采取对策的探讨_刘瑾
《不同灌注方法及灌注量对大鼠脑组织及神经元固定的影响》
徐一菲自动组织脱水机控制程序的编制与应用_姚海嵩
全自动密闭式脱水机操作方法的改进_李泳

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END
免责声明
本方案仅用于科研实验，不适用于临床。

队长是我

主要是高浓度酒精和二甲苯。无水酒精和二甲苯的时间要把握好，尤其是小标本，时间不能过长了，低浓度的话时间长一点短一点问题不大。小标本高浓度酒精和二甲苯一般是20分钟每缸。