疏水层析蛋白纯化实验怎么做？

虎威将军

疏水相互作用层析 (Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC) 根据生物分子疏水性的差异，在相对温和的条件下分离分子。
许多科研工作者将HIC用于蛋白质纯化，作为根据电荷、尺寸或生物特异性识别进行分离等技术的补充。
在分离过程中，科研工作者以较小的体积纯化和洗脱样品，这样可以浓缩样品，使其可直接进行尺寸排阻层析，或者在缓冲液置换后进行离子交换分离。可以将HIC用于纯化方案中的捕获、中度纯化或精纯步骤。Cytiva生产的填料可用于实验室的小规模分离，也可用于生产千克级产品。
本期层析纯化小课堂将从疏水相互作用层析的理论和应用两方面出发，带大家探索奥秘，熟练选择和运用Cytiva疏水相互作用层析填料产品。



图1：蛋白质根据其表面疏水性的差异进行分离（黄色表示疏水性氨基酸残基，蓝色表示亲水性氨基酸残基），如图所示标准蛋白在Phenyl Sepharose High Performance填料进行分离纯化

HIC是根据蛋白质表面疏水性的不同，利用蛋白质和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离蛋白质。运行缓冲液中的某些盐会显著影响蛋白质和HIC填料相互作用的方式。高盐浓度会增强相互作用，而低盐浓度会减弱相互作用。
在图1所示的例子中，所有四种蛋白质都与HIC填料的疏水表面相互作用。但是当降低缓冲液的离子强度时，这种相互作用就会逆转，疏水性最低的蛋白质会首先洗脱。疏水性最强的蛋白质会最后洗脱，这需要更大程度地降低盐浓度来逆转相互作用。

疏水相互作用层析纯化基本步骤
疏水作用层析作为一种吸附性层析，主要步骤包括平衡、上样、清洗、洗脱和再生步骤。疏水作用层析一般在高盐环境中上样，经过上样和清洗之后，通过降低洗脱液中的盐浓度逐渐对不同的分子进行洗脱。其流程可参考下图（图2）：



图2：疏水作用层析流程图

常见疏水相互作用层析填料选择
疏水填料和离子交换填料类似，都是由基架和疏水配基交联而成，常见的疏水填料配基有Phenyl、Butyl、Octyl等，常见疏水填料的疏水性强弱如图所示：



图3：常见疏水填料的疏水性强弱图

用于HIC填料的基架

_	填料	粒径
现代填料	Capto ImpRes	40 μm
Capto	75 μm
传统填料	Sepharose High Performance	34 μm
Sepharose 6 Fast Flow	90 μm
Sepharose 4 Fast Flow	90 μm
SOURCE 15	15 μm

Sepharose填料是基于琼脂糖基架的，具有高流速与高分辨率不同区分的填料，可根据纯化过程对分辨率的要求程度、结合载量及流速选择最合适的填料。
Capto填料比Sepharose基架填料具有更高的刚性，且反压更低，使得该填料具有更好的稳定性，更适合于具有规模放大的应用需求。
SOURCE基架由聚苯乙烯和二乙烯基苯制成，产生高度球形（单分散）、小 (15 μm) 的多孔颗粒，有助于在高流速下实现高分辨率分离。

疏水相互作用层析应用指南
01填料的选择
HiTrap Capto HIC Selection Kit和PreDictor Capto HIC Screen kit。



图4：HiTrap Capto HIC选择套件和PreDictor Capto HIC筛选套件

在实验的初始阶段，使用小型 (1 mL) 预装填层析柱，例如HiTrap Capto HIC选择套件中的层析柱（图4），或预装填有不同Capto HIC填料（例如PreDictor Capto HIC筛选套件）的96孔板进行测试。这种筛选方法能根据所需的选择，快速、高效地筛选各种填料。

02样品上样和清洗
将样品调节至选定的盐浓度（如有必要，调节pH值 ）。过滤，并上样到层析柱。
用5至10个CV的起始缓冲液清洗，或直到紫外基线和电导率稳定，这表示所有未结合的物质都已通过层析柱进行清洗。

03洗脱
线性梯度洗脱
目的：高分辨率分离、填料筛选、理想盐条件筛选
使用10至20个CV的梯度体积开始洗脱。增加洗脱缓冲液的比例，直到盐浓度达到最低，即不含盐的缓冲液 (100% B) 。
梯度洗脱的变化可以通过几种方式改变疏水性蛋白质在填料上的保留：
长而浅的梯度使峰之间的分离最大化，但是分离时间会更长，并且会有更大的峰展宽。
短而陡的梯度分离速度更快，峰更尖锐，但峰之间的洗脱距离更近。
梯度中较晚洗脱的峰往往比较早洗脱的峰稍宽。
选择最陡的梯度以获得可接受的分辨率。图5显示了梯度斜率变化的影响。



图5：示例层析图显示了梯度斜率降低后的影响

步级梯度洗脱
目的：加快分离时间、减少缓冲液消耗、组分分离
用最多5个CV的洗脱缓冲液，以低于起始缓冲液的盐浓度洗脱结合的蛋白质。重复上述步骤，降低每一步的盐含量，直到洗脱出目标蛋白质。



图6：使用步级洗脱的典型HIC分离。紫外线（蛋白质）和电导率（盐）曲线显示了蛋白质的洗脱、峰以及洗脱过程中盐浓度的变化

如图6所示，可以通过依次添加盐浓度递减的洗脱缓冲液来执行步级洗脱：
第1步：优化盐浓度和洗脱缓冲液的体积，以洗脱所有与填料结合强度低于目标蛋白质的化合物。
注：盐浓度和缓冲液体积应足够大，以洗脱污染较弱的结合物质，但应保持盐浓度足够低，以便将感兴趣的峰共洗脱。
第2步：降低盐浓度，直到目标蛋白质洗脱。
注：应该保持足够低的盐浓度，以便在不过度稀释的情况下洗脱目标蛋白质，但同时也要保证足够高的盐浓度，以防止强结合污染物共洗脱。
第3步：进一步降低盐浓度以洗脱所有残留的污染物。此步也可以用水。
第4步：在起始缓冲液中再平衡层析柱，为下一次运行做准备。

04清洗和在平衡
用2至5个CV的无盐洗脱缓冲液清洗，洗脱任何残留的疏水结合物质。
用5至10个CV的起始缓冲液再平衡，或直到电导率达到所需值。

05清洁
要去除沉淀蛋白质等常见污染物，可以使用以下操作。流速：
1 mL/min，HiTrap 1 mL；
5 mL/min，HiTrap 5 mL；
3 mL/min，HiPrep 16/10，20 mL；
40 cm/h，接触时间为1至2 h，适用于装填在较大层析柱中的Sepharose High Performance。
注：由于层析柱的条件和样品、缓冲液或保存液的粘度，可能需要降低流速。
1 用最多4个CV的1 M NaOH清洗。
2 用至少3个CV的水清洗，或直到洗脱液pH为中性。
3a 要开始新的分离：用至少3个CV的起始缓冲液再平衡，或者直到达到正确的洗脱液pH值。
3b 储存时，用至少5个CV的保存液清洗。储存层析柱前，让紫外基线稳定下来。

06化学稳定性
对于日常使用，疏水相互作用层析填料在常见的水性缓冲液、1 M NaOH、变性剂（8 M尿素、6 M盐酸胍）、70%乙醇、1 M乙酸、30%异丙醇、30%乙腈和最高达2%的SDS中保持稳定。

07储存
对于层析柱储存，先用5个CV的蒸馏水清洗，然后用5个CV的20%乙醇清洗。将乙醇和水的混合物彻底脱气，并以低流速上样，以避免对层析柱过度加压。将层析柱密封好，以防干燥。在4°C至30°C下，将层析柱和未使用的填料储存在20%乙醇中。不要冷冻。
本文转载自：Cytiva学堂

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