干货 | 小动物活体成像之生物发光精华篇

临床医师

小动物活体成像技术，是在1999年美国哈佛大学Weisslede提出的一项技术，该技术是指应用影像学方法, 对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究。


传统的动物实验需要在多个时间点分批处死动物以获取实验数据，而小动物活体成像技术可同时观测多个实验动物、对同一研究个体可进行持续、反复跟踪成像，避免屠杀动物而造成的组间差异，节省动物成本，被广泛应用于生命科学研究领域。

其中小动物活体光学成像是通过一定方式对小动物进行光学标记，再通过成像技术及设备(如Revvity IVIS高端小动物活体光学成像系统)对采集光信号，主要包括生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。

PART/1

生物发光VS荧光



PART/2

生物发光成像原理
生物发光成像是指通过基因工程将荧光素酶报告基因插入细胞、细菌、病毒等基因组中，使其能够正常表达，再将细胞、细菌或病毒转移到动物体内构建稳定表达荧光素酶的转基因动物，向动物体内注射荧光素底物，底物与荧光素酶发生反应产生光信号，发光的强度与标记细胞的数目呈线性关系，可以分析动物体内特定的基因表达、细胞发育和相关生物学进程。
常用的荧光素酶有两种，分别是萤火虫荧光素酶(Luciferase) 和海肾荧光素酶(Renilla)，萤火虫荧光素酶所用的底物是D-luciferin(逐典货号：CY057F1000)，光波长在540-600 nm，更容易透过组织，特别适合动物深部组织成像，大部分体内实验常用其作报告基因；海肾荧光素酶的底物是coelentarizine ，光波长在460-540 nm，在体内的代谢较快。


图1.生物发光成像原理示

PART/3

生物发光成像实验步骤
01
标记肿瘤细胞
构建荧光素酶重组质粒，细胞转染，挑选单一抗性细胞克隆。
02
筛选阳性克隆细胞株
单一抗性克隆传代，用Luciferase Assay System检测荧光素酶活性(逐典货号：CY058F1000KIT)，保留RLU值维持较高的克隆直至第30代，将筛选出高效表达、阳性率接近100%的细胞株进行培养。
03
构建动物模型
根据实验目的选择皮下移植、原位移植、尾静脉注射等方式接种已标记的肿瘤细胞。
04
注射底物荧光素
采用腹腔注射或尾静脉注射荧光素底物到小鼠体内，推荐浓度是15 mg/ml，10 g小鼠需要1.5 mg的荧光素底物，等待3min，然后给动物进行常规麻醉(气麻、针麻皆可)。
尾静脉注射：皮下移植瘤、全身性肿瘤、颅内肿瘤模型。
腹腔注射：无特殊要求均可采用（大都采用此注射法）。
05
生物发光成像
注射荧光素底物后，约1 min扩散到小鼠全身,10 min后强度达到稳定的最高点,在最高点持续约20-30 min后开始衰减，约3 h发光全部消失，建议根据动力学曲线确定具体时间。
06
萤光素酶活性的动力学曲线
将麻醉后的动物放置在成像室并拍摄第一张图像后，每5-10 min连续拍照，持续40 min，获得模型动物的D-萤光素钾盐吸收动力学曲线。

PART/4

生物发光成像效果影响因素

1.报告基因转录
每个细胞都应该包含相同拷贝数的报告基因。
2.启动子的活性
启动子的活性高，则荧光素酶的表达高，启动子的活性低，则荧光素酶的表达低。荧光素酶表达量和发光强度成正比。根据此原理，用特定的启动子驱动荧光素酶，来观察该启动子在活体动物体内的特定条件下的表达情况，并检测影响该启动子表达的因素。
3.荧光素底物注射方式
荧光素底物注射的方式及其准确性影响生物分布，从而影响其局部组织浓度。
4.成像时间
荧光素底物在体内一般10 min后强度达到稳定的最高点,在最高点持续约20-30 min后开始衰减，约3 h发光全部消失，建议根据动力学曲线确定具体时间。
5.小鼠的毛发
小鼠毛发对光具有吸收及散射作用，建议对实验小鼠剃毛。

PART/5

逐典高品质D-荧光素钾盐


逐典D-萤光素钾盐，其优点在于纯度高（HPLC>=99%）,经验证的优异的生物发光性能，以及高溶解度。游离形式的荧光素溶解度较差，而钾盐形式能做到较好的水溶性，逐典开发的高纯度D-荧光素钾盐溶解度可达40mg/ml以上。

产品卖点：
01
高纯度（HPLC验证纯度≥99%）



02
高溶解度，溶解度可达40 mg/ml

03
优异的生物发光性能


底物过量条件下，荧光素酶浓度与荧光强度呈线性关系，与竞品P品牌产品相比，性能相当

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客户反馈





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