关于免疫荧光和免疫组化图片如何看?

莺歌燕舞

关于免疫荧光和免疫组化图片如何看?
原文地址：https://www.zhihu.com/question/578867783

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Q：我的结果拍出来全视野都是荧光信号（如下图），这是怎么回事呀？




A：这个成像的情况多半是过曝啦！造成过曝的原因就是仪器的曝光时间设置不合适，我们的荧光染料强度比一般的染料都要强，且不容易淬灭，一般情况下在3-5ms的曝光时长就能够有荧光信号了，最长也不会超过20ms（除非是放了很久发生淬灭的片子），您可以看一下您的显微镜/扫描仪的曝光时长，如果时间过长就会出现全片都是荧光信号的情况。如果您不是手动设置的曝光时长，是仪器自动曝光的，那出现这种情况有可能是您的阳性信号太弱了，仪器在短曝光时长没有信号，所以自动延长了曝光时长再拍，这就有可能把背景大量曝出来。您可以尝试手动进行曝光时长调整，如果缩短时长以后背景变弱但阳性信号也很弱，就需要调整抗体浓度和抗体孵育时间；如果缩短时长以后背景依旧很强，请确认染料是否孵育时间过长，我们的染料孵育最长不超过10min，甚至3-5min就已经能够孵育出信号了，时间过长就会出现全片都是信号的情况。

Q：我染出来的结果怎么有一些位置所有通道都有颜色？而且也不是阳性信号




A：这个情况是因为这个位置坏死或者没处理干净，导致这种位置可能有大量蛋白碎片或者是组织液，亦或者是血液，这些杂质都有可能吸附我们的TSA染料，染料的大量沉积，导致这些位置出现强非特异性。所以咱们在取材的时候，尽量避开坏死区域，像灌流清洁这些前处理也要做好，样本的质量决定最终染色的质量哦。（经验之谈：血细胞容易吸附短波长的染料，如果有些样本确实没办法灌流更干净了，可以考虑避开这些染料，至于具体是哪些染料，各厂家有些微区别，Absin这边主要是TSA480容易吸附血细胞，如下图）




Q：这个指标我做免疫荧光的时候效果很好的，怎么你们多色做出来信号完全不对？




左IF；右mIHC


A：首先您需要确认您的抗体是否有IHC应用哦，如果您用的是IF的抗体，跟我们这个实验就不太符合哦，我们多色的荧光染料是独立在抗体之外的，需要通过HRP的二抗去催化显色，跟IHC里面用HRP二抗催化DAB显色类似，所以需要IHC应用的抗体，免疫荧光则是把荧光素直接连接在抗体上，所以大家在一抗上面还是有些区别。另外，如果您手里的抗体厂家写了既能做IF也能做IHC，那我们多色的效果需要跟免疫组化（IHC）的效果去做对比哦，您可以染一个免疫组化看一下形态样子、背景情况，看看跟多色是否相似，如果组化背景不干净，多色也会有很高背景哦。
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