蛋白纯化--免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）

青草

总述：免疫沉淀（IP）是一种利用抗原与抗体的亲和力，从溶液中特异性分离抗原的方法。常常借助此技术来分离纯化目的蛋白。纯化后的蛋白可以利用SDS-PAGE、western-blot等实验方法来进一步分析。
<hr/>免疫沉淀的原理：



免疫沉淀原理图

首先需要获得含有目的蛋白的混合物，然后将一抗加入混合液中去识别目的蛋白，接着加入固定了proteinA/G或第二抗体的磁珠或琼脂糖颗粒，使抗原-抗体复合物附着在磁珠或琼脂糖上，最后充分洗涤磁珠，然后用酸或SDS溶出目的蛋白。
当没有合适的抗体时，可以先将目的蛋白与His-tag等标签融合表达，使用融合标签的看题进行免疫沉淀，对目的蛋白进行纯化。

ProteinA：20世纪中期，Jensen发现有一种蛋白可以与人和兔血清抗体广泛结合，该蛋白于1964年首次被称为Protein A。  Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量42KD，它能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段而与Fab区或轻链结合很弱。天然的Protein A有5个IgG结合结构域和未知功能的非Fc结合域，结构示意图如下：



ProteinA结构示意图

此结构的蛋白A大量结合IgG的同时，其非Fc结合域能结合部分杂蛋白，导致洗脱下来的IgG纯度不够，因此科学家利用基因工程的方法克隆Protein A的基因并进行改造，得到重组型蛋白A，其非特异性结合明显降低。重组的蛋白A经过改造后有一个C端的半胱氨酸，可以单点偶联到琼脂糖上，降低空间位阻的同时提高IgG的结合能力。一步亲和层析后样品纯度可超过90%。
ProteinG：蛋白Ｇ来自于链球菌Ｇ族的细胞表面蛋白，是III型Fc受体，分子量为25KD，其通过类似于蛋白A的非免疫机制而结合抗体的Fc段，蛋白G与蛋白A均可结合抗体的Fc段，不同的是，蛋白G还能结合Fab段，且蛋白G可以更广泛的结合更多类型的IgG分子，多克隆IgG分子，同时蛋白G与血清蛋白结合水平低，产物纯度高，且配基脱落更低。蛋白G可以纯化不能与蛋白A结合的哺乳动物抗体。重组型的蛋白G经改造后已经去除了白蛋白结合位点（血清白蛋白是抗体来源的主要污染物）及细胞表面结合位点，减少了非特异性结合。
蛋白A对兔来源抗体的亲和力较高，蛋白G对于小鼠等部分哺乳动物抗体的亲和力较高。
固相化载体--琼脂糖颗粒和磁珠：琼脂糖颗粒为网状结构，即使在颗粒内部也可以与抗体结合。因此，与目的蛋白的结合量也会变大。磁珠为简单的球形，操作简便，可以缩短实验时间。如果磁珠表面有合适的涂层，可以降低背景。但有时会出现结合量不足的情况，与琼脂糖颗粒相比，价格稍高。
表面活性剂：一般来说在免疫沉淀中，为了减少蛋白质间以及蛋白质-磁珠间的非特异性结合，可以添加最佳浓度的盐和中性表面活性剂。但是，添加表面活性剂后，有时也会使抗体结合力降低，因此，在使用单克隆抗体时，需要进行预实验。
蛋白分解酶抑制剂：在细胞裂解物和组织提取物等样品中包含的蛋白质分解酶（蛋白酶），可以分解目的抗原以及添加的抗体。因此，为了防止分解可以加入蛋白质分解酶抑制剂。当样品中含有的蛋白质分解酶种类可以确定或预测时，可以使用与其相适应的抑制剂。无法确定时，一般将PMSF和EDTA等低分子抑制剂进行组合使用。
洗脱：一般使用含有2-巯基乙醇（2-ME）等还原剂的SDS样品缓冲液洗脱。洗脱液中，除了目的蛋白，还含有所使用的抗体。在免疫印迹与质谱分析时需要注意。
<hr/>免疫沉淀的实验方法：
方法1：使用未标记抗体与琼脂糖颗粒
01第一抗体反应
（1）在1.5mL离心管中，加入蛋白提取液500μL以及第一抗体2~10μg。
（2）置于旋转混匀器上，在4℃下使其反应1小时〜过夜。


02第二抗体反应
（1）加入结合了第二抗体（或者proteinA/G）的琼脂糖颗粒。
（2）置于旋转混匀器上，在4℃下使其反应1小时〜过夜。
03洗涤
（1）离心收集琼脂糖颗粒，吸引除去上清，但注意不要吸出琼脂糖颗粒。
（2）加入1mL预冷的洗脱液或洗涤缓冲液，混匀后，进行离心，除去上清液，注意不要吸出琼脂糖颗粒。此操作重复进行 3〜4次。
（3）加入50μL含有2-巯基乙醇（2-ME）的2xSDS样品缓冲液，加热5分钟，使目的蛋白从颗粒上分离。离心后，将上清作为SDS-PAGE样品进行使用。
注：在保持蛋白质活性和三维结构的条件下进行提取无需在酸、碱等苛刻条件下，只在中性条件下使用洗脱用多肽进行提取。
方法2―使用标签抗体结合磁珠
01Input样品的制备
（1）处理样品时需要样品保持低温。向293T细胞（1×107 细胞）中加入50mM Tris、150mM NaCl（pH8.0）、1.2mL的1%NP-40，旋转混匀。然后在12,000 rpm的条件下离心5分钟。回收1mL上清，加入10 µL（＝25 µg）的His-Flag-V5-GFP（2.5 mg/mL），制备Input样品。（另外取10 µL作为SDS-PAGE的Input样品使用。）
02抗体反应
（1）每次取50 µL Anti-V5-tag mAb-Magnetic Beads（10mg/mL）装入离心管中，然后用1mL的NET-2 缓冲液洗涤1次。（磁珠容易沉淀，使用前请进行充分的旋转混匀）
（2）接下来，将制备好的Input样品以每份400µL的量加入到磁珠（Magnetic beads）中，并在4°C下旋转60分钟。
（3）然后用1 mL的NET-2缓冲液洗涤4次。（盖子上粘附的东西也需清洗干净）由于可以通过磁力固定，因此在洗涤过程中几乎没有样品损耗。
接下来将写一写CoIP、RIP、ChIP各个实验方法的原理和目的。

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