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大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。
免疫逃逸是癌症进展的关键里程碑，是肿瘤免疫治疗的理论基础。头颈部鳞状细胞癌（(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)）是全球最常见的恶性肿瘤之一，传统治疗选择包括手术切除、放疗和化疗。最近，利用免疫检查点抑制剂如PD-1/PD-L1单克隆抗体的免疫疗法，已成为治疗难治性复发/转移HNSCC的有希望方法。但超过80%患者仍然表现出固有的药物抗性，不能单独从PD-1/PD-L1免疫疗法中受益。其他免疫检查点分子在HNSCC免疫逃逸中的潜力，影响抗PD-1/PD-L1免疫疗法的效果。因此，进一步探索HNSCC免疫逃逸机制具有至关重要的意义。
人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV）感染与多种HNSCC发生发展相关，HPV16、18、31、33和35等高风险类型，易于诱发各种人类恶性肿瘤，其中HPV16是最普遍的高风险亚型。最近发现HPV可以编码环状RNA（circRNA），而circE7是唯一被鉴定出由高风险HPV16特异性编码的环状RNA。circE7通过影响宿主细胞的表观遗传调控，可能参与肿瘤免疫逃逸和免疫治疗抗性形成。但circE7的生物学功能仍然大部分未知，它在肿瘤免疫逃逸和免疫疗法抗性中的参与尚未被报道。
2024年10月4日，中南大学博士后葛军尚、博士生孟依、硕士生郭佳玥为并列第一作者，中南大学基础医学院曾朝阳、熊炜和中南大学湘雅二医院口腔医学中心龚朝建为共同通讯作者，利用染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-seq）等实验揭示了HPV编码的环状RNA  circE7促进头颈部鳞状细胞癌的免疫逃逸机制。相关研究成果以“Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma”为题发表在Nature子刊《nature communications》上。①易基因科技为本研究提供ChIP-seq测序分析技术服务。


标题：Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma（HPV编码的环状RNA  circE7促进头颈部鳞状细胞癌的免疫逃逸）
期刊：Nature Communications
影响因子： IF 14.7 / 1区
技术平台：RT-qPCR、RNA pulldown、western blot、ChIP-seq、RIP实验、动物实验等


本研究通过整合23对HNSCC肿瘤样本及其邻近正常组织，以及105个HNSCC患者的石蜡包埋样本，结合细胞和动物实验，首先观察到circE7表达与HPV HNSCC临床组织中浸润的T细胞呈负相关。体外和体内实验进一步证实，circE7通过表观遗传机制下调LGALS9基因（编码Galectin-9蛋白），从而抑制T细胞功能和活性，进而促进HNSCC免疫逃逸。而LGALS9基因编码的galectin-9蛋白能够与T细胞表面的TIM-3和PD-1等免疫检查点分子结合，进而激活T细胞释放细胞毒性细胞因子并抑制T细胞凋亡。circE7下调Galectin-9，导致CD8+T功能和活性受到抑制；而circE7下调LGALS9表达的具体分子机制是circE7结合并抑制乙酰辅酶A羧化酶1 (acetyl-CoA carboxylase 1, ACC1)的磷酸化和激活，降低细胞内乙酰辅酶A水平，导致LGALS9启动子区域H3K27乙酰化水平降低，通过表观遗传调控抑制LGALS9的表达；最后通过体内外模型证实联合使用TIM-3 (Galectin-9在T细胞上的受体)与PD-1单克隆抗体能显著提高HNSCC的免疫治疗效果。②
总之，本研究展示了HPV通过circE7驱动的表观遗传修饰促进HNSCC免疫逃逸机制，并提出了联合使用抗PD-1和抗TIM-3抑制剂的HNSCC潜在免疫治疗策略，这种联合治疗选择可以增强HNSCC免疫疗法的效果，为头颈鳞癌免疫治疗提供了新靶点和潜在治疗策略。

结果图形
（1）circE7在HPV+（阳性）的HNSCC中表达，并与T细胞浸润和galectin-9表达呈负相关。


图1：circE7在HPV+ HNSCC中高表达，且与CD8+ T细胞功能和免疫检查点galectin-9表达呈负相关。A. 通过设计跨剪接位点引物并使用Sanger测序，鉴定circE7为通过HPV16 E6尾部、E7和部分E1序列的反向剪接形成的472nt环状RNA。
B. 使用23个HNSCC组织进行RT-qPCR检测CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表达，并分析了它们与circE7表达的相关性。与circE7阴性样本相比，circE7阳性HNSCC样本中CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表达显著降低。（circE7阴性，n=16；circE7阳性，n=7）。
C. 在105个HNSCC组织中，通过原位杂交检测circE7表达。通过免疫组化检测浸润CD8+ T细胞中p16、HPV16 E7蛋白和CD8A的表达。在这105个HNSCC病例中，有17个是HPV阳性，所有这些病例都是HPV16阳性且circE7表达。circE7表达水平与CD8+ T细胞浸润呈负相关。（HPV阴性，n=88；HPV阳性，n=17）。
D-F.  在HPV阴性HNSCC细胞系CAL27和HN30中过表达circE7，或在HPV16阳性HNSCC细胞系SCC090和SCC154中转染靶向circE7的siRNA。RT-qPCR（D）检测LGALS9 mRNA，western blotting（E）和流式细胞术（F）检测galectin-9蛋白表达。
G. 在（B）中使用的23个新鲜HNSCC组织样本上进行RT-qPCR检测LGALS9 mRNA。与circE7阴性组织相比，circE7阳性HNSCC组织中LGALS9 mRNA水平显著降低。（circE7阴性，n=16；circE7阳性，n=7）。
H. 通过免疫组化在（C）中使用的105个HNSCC组织上检测galectin-9表达，并分析其与circE7表达的相关性。（circE7阴性，n=88；circE7阳性，n=17）。

（2）circE7通过下调LGALS9表达促进HNSCC免疫逃逸


图2：circE7下调HNSCC细胞中galectin-9表达，以体外抑制CD8+ T细胞功能。
在CAL27、HN30、SCC090和SCC154细胞中，过表达或敲低LGALS9，随后与人原代T细胞以1:10的比例共培养6小时。

• 通过RT-qPCR检测原代T细胞中IFNG、GZMB和TNFA的表达水平。在CAL27和HN30细胞系中，同时过表达circE7和LGALS9。在SCC090和SCC154细胞系中，同时敲低circE7和LGALS9。然后将这些细胞与人原代T细胞共培养6小时。
  
• T-qPCR用于检测IFNG、GZMB和TNFA mRNA表达。
  
• 通过ELISA检测共培养基中IFN-γ、GZMB和TNF-α的水平。
  

D-E. 流式细胞术以鉴定总CD8+ T细胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T细胞的比例。
F. 通过Annexin V/PI染色后进行流式细胞术以评估凋亡CD8+ T细胞比例。
G. 使用Annexin V/PI染色后进行流式细胞术以凋亡肿瘤细胞比例。

（3）Galectin-9通过与TIM-3和PD-1结合增强CD8+ T细胞的抗肿瘤活性


图3：Galectin-9通过与TIM-3和PD-1结合增强T细胞的功能和活性。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154细胞中，进行Galectin-9过表达或敲低，然后加入10mg/mL乳糖，并与人原代T细胞以1:10比例共培养6小时。

• 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。
  
• 使用Annexin V/PI检测评估CD8+ T细胞的凋亡水平。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154细胞中，进行Galectin-9过表达或敲低，然后加入5μg/mL抗PD-1和抗TIM-3，并与人原代T细胞以1:10的比例共培养6小时。
  
• 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。
  
• 使用Annexin V/PI检测评估CD8+ T细胞的凋亡水平。此外，人原代T细胞与1μg/mL重组Galectin-9蛋白共培养，同时加入抗TIM-3、抗PD-1和乳糖。
  
• 使用Annexin V/PI检测评估CD8+ T细胞的凋亡水平。
  
• 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。人原代CD8+ T细胞与1μg/mL重组Galectin-9、HMGB1蛋白和抗TIM-3共培养。
  
• 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。BSA为阴性对照。
  
• 流式细胞术检测附着在CD8+ T细胞表面的Galectin-9和HMGB1蛋白水平。
  

（4）circE7结合并激活ACC1以抑制乙酰辅酶A（acetyl-CoA）并抑制Galectin-9表达


图4：circE7表观遗传下调ACC1介导的Galectin-9表达。

• 使用生物素标记的circE7探针进行RNA pulldown分析，以检测CAL27和HN30细胞中circE7与ACC1蛋白之间的结合。非生物素标记的circE7探针用作对照。
  
• 在circE7过表达的CAL27和HN30细胞、或HPV阳性SCC090和SCC154细胞中，使用抗ACC1抗体进行RIP检测ACC1蛋白与circE7的结合，然后RT-qPCR定量分析。
  
• 使用抗Flag抗体进行RNA免疫沉淀，以评估ACC1蛋白与其截断突变体与circE7的结合，然后对circE7进行RT-qPCR分析。
  
• 使用生物素标记的circE7探针进行RNA pulldown，并使用抗Flag抗体进行western blot，以检测circE7与ACC1及其截断突变体之间的结合。
  
• 使用抗ACC1抗体进行RNA免疫沉淀，以评估ACC1蛋白与circE7及其截断突变体之间的直接结合，然后对circE7及其截断突变体进行RT-qPCR分析。
  
• 使用生物素标记的circE7探针进行RNA pulldown，以研究circE7及其截断突变体与ACC1蛋白之间的结合。在CAL27和HN30细胞中过表达circE7，或在SCC090和SCC154细胞中转染si-circE7。
  
• western blot检测总ACC1蛋白和p-ACC1蛋白的表达水平。
  
• 使用乙酰辅酶A检测试剂盒检测细胞裂解物中的乙酰辅酶A含量。
  
• western blot检测整体乙酰化的表达水平。
  
• western blot 检测H3K27 Ac、H3K9 Ac、H3K14 Ac和H3K23 Ac的表达水平。
  
• 在HN30细胞中过表达circE7，ChIP-seq peaks显示LGALS9启动子区域的H3K27ac水平。横轴代表基因组坐标，纵轴代表ChIP-seq信号强度。
  
• ChIP-qPCR用于研究在CAL27和HN30细胞中过表达circE7或在SCC090和SCC154细胞中敲低circE7后LGALS9启动子区域H3K27乙酰化水平变化。
  

图4-1：HN30细胞中过表达circE7的ChIP-seq和ChIP-qPCR分析。

• 在HN30细胞中过表达circE7，CHIP-seq peaks显示H3K27ac的整体水平。
  
• hockey stick plot显示在HN30细胞中，与Vector和OE-circE7相比，突出显示SE相关基因的input归一化、等级排序的H3K27ac信号。
  
• 在GSE1855312和ENCODE数据库中分析LGALS9启动子区域的H3K27Ac水平。
  

图5：ACC1是circE7在LGALS9转录表观遗传调控中的关键下游调控靶点。

• 三个ACC1 siRNA被转染到CAL27和HN30细胞中，或在SCC090和SCC154细胞中过表达ACC1，使用RT-qPCR检测LGALS9 mRNA表达水平。
  
• 使用Western blot检测ACC1和galectin-9蛋白的表达水平。在CAL27和HN30细胞中过表达circE7的同时敲低ACC1，或者在SCC090和SCC154细胞中敲低circE7的同时过表达ACC1。
  
• 使用RT-qPCR检测LGALS9 mRNA的表达水平。
  
• 使用Western blot检测ACC1、H3K27 Ac和galectin-9蛋白的水平。在CAL27和HN30细胞中过表达circE7的同时加入ACC1的小分子抑制剂TOFA。
  
• 使用RT-qPCR检测LGALS9 mRNA的表达水平。
  
• 使用Western blot检测H3K27Ac和galectin-9蛋白水平。
  

（5）TIM-3和PD-1单克隆抗体的联合应用大大提高了HNSCC免疫治疗效果


图6：外源性TIM-3和PD-1单克隆抗体的联合治疗增强了CD8+ T细胞的细胞毒性功能。
CAL27和HN30细胞进行circE7过表达，或SCC090和SCC154细胞circE7敲低，然后与人原代T细胞共培养6小时，加入5μg/mL抗PD-1或抗PD-1/TIM-3。

• 使用RT-qPCR检测CD8+ T细胞中IFNG、GZMB和TNFA mRNA的表达水平。
  
• 使用流式细胞术检测所有CD8+ T细胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T细胞的比例。
  C-D. 使用Annexin V/PI染色评估CD8+ T细胞（C）和肿瘤细胞（D）的凋亡水平。
  

图7：TIM-3和PD-1单克隆抗体的联合治疗显著提高了HNSCC免疫治疗效果。
裸鼠通过右后肢注射1×10^6过表达circE7的HN30细胞或载体对照，或注射敲低circE7或NC对照的SCC090细胞来形成异种移植肿瘤。7天和14天后，注射人原代T细胞和20μg/每个的抗PD-1或抗PD-1/TIM-3进行免疫治疗。
A-B. T细胞被标记为DeepRed，进行体内成像以检测携带肿瘤小鼠中人原代T细胞的生存和分布（每组n=3）。A 代表性图像；B 注射后1、3、5和7天收集的肿瘤部位（右大腿底部）的DiR荧光信号与T细胞荧光强度比率的统计结果。颜色标尺代表小鼠T细胞的DiR荧光强度。

• 代表性肿瘤图像。左图，HN30细胞注射后24天（每组n=6）；右图，SCC090细胞注射后56天（每组n=6）。
  
• 每周实时测量注射HN30或SCC090细胞的小鼠的肿瘤体积（每组n=6）。
  
• 通过免疫组化检测石蜡包埋的HN30和SCC090异种移植肿瘤中Galectin-9表达，并对结果进行统计分析（每组n=6）。
  
• 通过免疫组化检测HN30和SCC090异种移植肿瘤中CD8A的表达，并对结果进行统计分析（每组n=6）。
  

图8：小鼠原位移植模型显示PD-1和TIM-3单克隆抗体的联合使用增强了HNSCC免疫治疗的疗效。C3H小鼠在右侧脸颊注射2×10^5过表达circE7的SCC-7细胞或载体对照，形成异种移植肿瘤。3天后，注射20μg/次的抗PD-1或抗PD-1/TIM-3进行免疫治疗。

• 代表性肿瘤图像（每组n=7）。
  
• 肿瘤体积在SCC-7细胞注射后3天、7天和10天的测量结果（每组n=7）。
  
• 注射SCC-7细胞后10天测量的肿瘤重量（每组n=7）。
  
• 从小鼠肿瘤组织中制备单细胞悬浮液，通过RT-qPCR检测IFNG、GZMB和TNFA mRNA表达（每组n=3）。
  
• 使用ELISA检测IFN-γ、GZMB和TNF-α的含量（每组n=3）。
  

F-G. 流式细胞术检测CD8+ T细胞的比例（F）以及总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比（G）（每组n=3）。
H. 通过免疫组化检测SCC-7异种移植肿瘤中Cd8A表达，并对结果进行统计分析（每组n=5）。

• 通过免疫组化检测石蜡包埋的SCC-7异种移植肿瘤中galectin-9表达，并对结果进行统计分析（每组n=5）。
  

关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。
DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。
应用方向：
ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位

• 转录因子和辅因子结合作用
  
• 复制因子和 DNA 修复蛋白
  
• 组蛋白修饰和变异组蛋白
  

技术优势：

• 物种范围广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验；
  
• 微量建库：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析；
  
• 方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。
  

技术路线：


易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。


参考文献：

• Ge, J., Meng, Y., Guo, J. et al. Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma. Nat Commun 15, 8609 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-52981-4
  
• 中南大学湘雅二医院官网：湘雅二医院口腔医学中心龚朝建团队揭示头颈鳞癌发病新机制 https://www.xyeyy.com/2/17/content_80964.html
  

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