GAPDH，Tubulin，Actin选哪个做WB内参更好？

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GAPDH,Tubulin,Actin是WB实验中最常用的三种上样内参（loading control），因被认为表达水平受环境因素影响较小，在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达或变化很小，所以被称为管家基因（house-keeping genes），是WB实验中校正上样量、检测上样过程中存在实验误差，保证实验结果准确性必不可少的。
然而三者之间有哪些区别，哪个更好？如何正确使用loading control呢？来和小编一起研究吧！
Actin
Actin即肌动蛋白，分子量42kDa，是一类形成微丝的球状多功能蛋白质，基本上存在于所有真核细胞中。哺乳动物至少有6种肌动蛋白异构体由不同的基因编码， 根据它们的等电点分为三类（α， β和γ），一般来说，α肌动蛋白存在于肌肉中（α-骨骼，α-主动脉平滑，α-心脏），而β和γ在非肌肉细胞中很突出（β-细胞质，γ1-细胞质，γ2-肠道平滑）。
Tubulin
Tubulin即微管蛋白，分子量约55 kDa，微管蛋白是球形分子，有两种类型：α微管蛋白(α-Tubulin)和β微管蛋白(β-Tubulin)。
GAPDH
GAPDH是糖酵解反应中的一个酶，分子量36kDa。广泛分布于各种组织中的细胞，几乎在所有组织细胞中都高水平表达，在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的，且很少受外部诱导物的影响。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达。
三者有哪些区别
GAPDH 是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。但是做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，GAPDH表达量有可能会受到诱导处理的影响。而 Actin 和Tubulin 是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性，如脑组织的 Tubulin 的表达会高一些（因为神经细胞的轴突和树突都由 Tubulin 维持结构），而 Actin 的表达量可能会低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了 Tubulin 的表达改变。心肌的 β-Actin 的表达量可能变少，而 α-Actin 表达量高。
研究人员检测了三种管家基因在5,10,20,30,40ug上样时线性范围，发现也各不相同（如图一）。
图一：



J Appl Physiol (November 26, 2014). doi:10.1152/japplphysiol.00840.2014


如何正确使用loading control
综上，没有一种内参可适用所有的组织和细胞样本，需要根据具体的样本情况及下游实验来选择不同的内参。如何正确使用内参呢？
1.考虑表达特异性
管家基因的表达并非完全恒定，在同一物种的不同组织中表达是高度可变的。
如图二：小鼠的肌肉、心脏、骨、头颅、脾脏及脂肪组织中Actin的表达量，发现在这些不同的组织中，表达量差异很大。
图二：



Total Protein Analysis as a Reliable Loading Control for Quantitative Fluorescent Western Blotting



Total Protein Analysis as a Reliable Loading Control for Quantitative Fluorescent Western Blotting

同一样品中，不同的管家基因表达也并非一致。
如图三：两种不同基因型的果蝇，对于Tubulin的表达有着巨大的差别，而Actin表达并没有明显差异。
图三：


2.考虑分子量大小
一般要选择目的蛋白与内参分子量相差至少5kD以上，才便于对结果分析。
3.内参是否受实验处理影响
部分管家基因的蛋白表达量也可能会受到实验处理影响，例如诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，尽量避免使用变化较大的内参。
4.细胞组分定位时需要使用对应的内参
并非所有实验都要使用管家基因为内参，例如做蛋白定位时，则需要使用对应细胞组分的内参，如膜蛋白（Na+/K+ ATPase），核蛋白（lamin）等。
图四：



The phospholipase A2 activity of peroxiredoxin 6 modulates NADPH oxidase 2 activation via lysophosphatidic acid receptor signaling in the pulmonary endothelium and alveolar macrophages. doi: 10.1096/fj.201500146R

5.使用总蛋白为内参更为标准
越来越多的研究证实，管家基因在不同样品、同一样品不同组织、甚至是同一组织不同部位以及病理条件下表达量具有很大的差异性，并且在应用的时候还会受到管家基因有效线性浓度范围的影响。基于以上原因，越来越多的研究人员建议染总蛋白作为内参，总蛋白的表达量不受影响，具有更宽的线性范围，灵敏度更高（如图一，图二显示）。
但要注意使用总蛋白为内参的时候，为了具有更好的线性范围和更严谨的结果，总蛋白的提取一定要获取尽可能多的蛋白，获得真正意义上的总蛋白，而非仅使用可溶性蛋白作为内参。通常使用的RIPA裂解液仅可获取可溶性蛋白，丢弃的沉淀团中仍然可检测出蛋白（如图五），且丢弃的蛋白部分会具有随机性。为了解决蛋白丢失这一问题，Invent公司开发出了柱式法蛋白提取方法，优化的裂解液配方可让蛋白更有效的溶出，配合离心管柱将核酸等杂质去除，迅速获取真正的总蛋白，无蛋白丢失，可做为良好的总蛋白内参！
图五：



BioTechniques 61:327 （December 2016）

综上所述，管家基因并非是一成不变的，loading control要根据样品本身和验证目的进行选择，如使用管家基因作为内参受限时，可选择使用总蛋白作为更可靠的内参。
（本文转自英文特生命科学）

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