技术 | 分子诊断中所使用的探针之二

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2、引物和探针中的核酸衍生物和类似物

正常的引物和探针由单链DNA/RNA分子组成，基于具有（脱氧）核糖磷酸酯框架的C5-核糖偶联核苷酸。自21世纪初以来，有可能替换、修改或替代一个、多个或全部核苷酸，以改变引物或探针的特性。在物理化学意义上，这些寡核苷酸在碱基配对方面遵循「沃森和克里克规则」，表现得与正常核苷酸一样。最突出的变异是蛋白核酸（PNA）和锁定核酸（LNA）。

2.1、肽核酸（PNA）

PNA是一种与DNA有关的分子，其糖-磷酸盐骨架被一个由N-（2-氨基乙基）-甘氨酸单位组成的重复分子结构所取代，并以肽键相互连接（见图7）。


图7 | PNA和DNA之间的比较。
蛋白质核酸（PNA）由一个肽的骨架组成，氮基附着在这个骨架上。肽骨架的独特结构使每个碱基（A、G、C、T）之间的距离与DNA分子中的相同。PNA在稳定性和杂交强度方面比DNA或RNA有许多优势。

DNA碱基是按其在DNA中的位置等距存在的。PNA是用化学方法合成的，可以用生物素或荧光色素（FITC、罗丹明、猝灭剂）等进行标记。PNA可以与DNA或RNA进行Watson和Crick碱基配对。由于其肽带，PNA分子对核酸酶有抵抗力。因此，它们比核酸要稳定得多。

然而，PNA分子的肽带对蛋白酶是敏感的。由于缺乏带负电荷的磷酸基团，杂交过程中发生的静电排斥较少，因此，探针和靶点之间的亲和力仅受盐浓度变化的影响很小。这导致了更高的Tm。因此，DNA：PNA组合的杂交能力高于同等长度的可比的DNA：DNA双联体。转化为引物和探针的杂交，这意味着使用PNA探针比使用DNA探针可以更好地检测点突变。

DNA聚合酶可以从PNA引物正常合成DNA。另外，PNA还可用于所谓的PCR夹层，即3′定位的点突变与非杂交的3'-PNA末端不能被拉长。

2.2、锁定的核酸（LNA）

LNA是一种基于RNA的类似物，具有双环核糖衍生物，其中核糖的O-2ʹ-和C-4ʹ-原子之间存在一个亚甲基桥（图8）。


图8|锁定的核酸（LNA）
碱基类似物在核糖的O-2′和C-4′原子之间提供一个甲基键。LNA核苷酸被纳入DNA中。
来源于生物合成（重新设计的）。
a DNA、RNA和LNA的单体的化学结构。
b 当一个核苷酸被LNA或PNA取代时，Tm增加。
c 在替换了3个或9个碱基的DNA寡核苷酸后，Tm增加。增加的程度取决于核苷酸的性质。A、C、G或T

由于所有四个氮基都可以被修饰成双环核糖，引物或探针的核苷酸可以部分或全部被LNA核苷酸取代。LNA改变了螺旋结构，加强了氮碱基和H桥形成之间的非共价作用。在引物或探针中加入一个或多个LNA分子，甚至比PNA更能提高杂交的特异性和亲和力。引物3′侧的LNA会阻止扩增；没有自由的3′-OH端可用于延伸。

LNA核苷酸在诊断中使用得比较多，例如，作为引物用于检测高GC含量的靶点（丙型肝炎病毒）或用于突变检测。一个LNA核苷酸可以取代引物中的某个核苷酸。可以使用更短的引物或更好地操纵反应条件。LNA也经常被用作探针中的碱基替代物。

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