层析技术概念、原理、分类（凝胶层析和离子交换层析） 互联网2013-01-22

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一、概念

利用混和物中各组分理化性质（吸附力、分子形状、大小、分子极性、分子亲和力以及分配系数）的差异，在物质经过两相中进行分离的一种技术。

本世纪初（1903年），俄国植物学家M.C.Jber发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素，还含有其他色素，实际上他使用的吸附层析。现在层系法已成为生化、分子生物学及其它学科领域有效的分离、分析工具之一。

二、原理
具体过程：

可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。

三、分类

1. 按两相所处物理状态分类

气相层析：气液层析（固定相为液体）和气固层析（固定相为固体），流动相为气体。

液相层析：液液层析（固定相为液体）和液固层析（固定相为固体），流动相为液体。

2. 按层析方式分类

柱层析：固定相装于柱内，使样品沿着一个方向移动而分离。

薄层层析：将适当粘度的固定相均匀铺在薄板上，点样后，用流动相展开。

纸层析：用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开。

3. 根据层析原理分类：常用分类法

（1）吸附层析：固定相是固体吸附剂，通过对不同溶质吸附力强弱不同进行分离。

（2）分配层析：利用两相中的分配系数不同。

分配系数：当一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（Kd）

Kd＝Ca / Cb

Ca和Cb分别代表某一物质在互不相溶的两相，A相（动相）和B相（静相）中的浓度。

（3）离子交换层析：固定相是离子交换剂，各组分与其亲和力不同

（4）凝胶层析：固定相是多孔凝胶，根据流动相中溶质的分子量大小差异进行分离

（5）亲和层析：利用固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，与溶质分子发生可逆的特异性结合进行分离

（6）金属螯合层析

（7）疏水层析

（8）反相层析

四、凝胶层析（又叫凝胶过滤或分子筛）
凝胶层析是指混和物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分类的技术。
1.  原理
凝胶层析的固定相是凝胶。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样。




常用凝胶有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶等。
葡聚糖凝胶介质是由多聚葡聚糖与环氧绿丙烷交连而成。最常用的葡聚糖凝胶层析介质是Sephadex G系列，不同型号的凝胶用G表示，G代表交联度，从G10到G100。“G”后面的数字表示每10g干胶的吸水量，可根据待分离混和物分子量大小选用不同“G”值的凝胶。
2.  分离过程：
样品随洗脱液的流动下移




3.  影响凝胶柱层析的主要因素
（1）层析柱的选择与装填
层析柱的大小应根据分离样品量的多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无汽泡。
（2）流动相――洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液，目的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物质，并不使其变性的缓冲液都可用于凝胶层析。
（3）加样量：加样量的多少应根据具体的实验而定：一般分级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1％－5％，而分组分离时加样量约为凝胶柱床体积的10%-25%.
（4）凝胶再生：葡聚糖凝胶再生使用NaOH（0.2M）和NaCl(0.5M)混合液处理。

五、离子交换层析
离子交换层析是利用固定相偶联的离子交换基团和流动相解离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应而进行的分离方法。
1.  原理
离子交换交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混和物中各种离子的一种技术。其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒之间的吸引力的作用。
离子交换层析的固定相是载有大量电荷的离子交换剂，流动相是具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。
离子交换剂按其所带电荷性质，分为：
阴离子交换剂带正电荷，与混合物中带负电的组分结合 阴离子交换层析。
阳离子交换剂 带负电荷，与混合物中带正电的组分结合 阳离子交换层析。
常用离子交换剂有：离子交换树脂，离子交换纤维素等
本实验用到的是二乙基氨基纤维素即DEAE-纤维素，属阴离子交换剂带正电荷，结合离子。
分离过程：也是柱层析，原理以阴离子交换层析为例：




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