PCR反应体系中,各试剂加样量是如何确定的?

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PCR反应体系中,各试剂加样量是如何确定的?
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RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)，也称为逆转录PCR，是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。RT-PCR实验需要追求一致性（稳定性），不管RNA上样量如何，反转录的效率都保持一致，确保cDNA的差异能够真实反映mRNA的差异。在进行RT反应之前，考虑以下几个方面，可以更好地进行RT-PCR实验。



图1逆转录示意图（图片来源于网络，侵删）

一、保证RNA质量
在提取RNA的过程中，要特别防止RNase的污染，同时在逆转录反应中通过加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。注意：RNase抑制剂要在第一链cDNA合成反应中且在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入。因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放RNase。
蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心避免样本被手上的RNase污染，实验过程中最好经常更换新手套。
二、选择合适的RT Primer
①Oligo dT
选择Oligo dT时，要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，最好不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
②随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5µg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5µg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（＜500bp）的增加和长片段、全长产物的降低。
③特异性引物
基因特异性引物（GSP）是某个基因序列的一部分，与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计。由于引物和RNA序列特异性结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，当分析多种目标时，则需要适用更多的RNA样本。而且不同引物退火温度本来就不相同，所以一般不推荐使用。如需要使用特异性引物，建议对退火温度进行优化。
三、尽量克服RNA复杂的二级结构



图2不同温度下的RNA（图片来源于网络，侵删）

如果要获取全长cDNA，那么RNA二级结构的问题就无可避免，一般的逆转录酶在遇到此类结构后，容易停止反应或从模板上脱落下来。要想判断模板RNA是否具有二级结构比较困难，但如果基因中GC含量较高，这通常意味着RNA很难被变性且结构较为复杂，此时需要65℃，5 min对其进行充分变性，打开复杂结构以避免其对实验结果的影响。
选用一款好酶也可以让实验事半功倍，凯基逆转录试剂盒(M-MLV)对逆转录酶RT（M-MLV)基因改造（提高热稳定性），该酶是在大肠杆菌中表达纯化得到的高温反转录酶，无RNase H活性，可在42-55℃下合成第一链cDNA，最佳反应温度50℃。灵敏度高，特异性高，聚合能力强（高亲和力可以竞争性地挤开二级结构，顺利地通读下去，同时也大大提高了反转录效率），热稳定性高，半衰期长，合成片段≤15Kb。其中RT反应体系为20uL，PCR反应体系为50uL。
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产品货号	产品名称	产品规格
KGF2206-2000	M-MLV反转录酶	2000 U
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KGF2104-200	逆转录试剂盒（M-MLV）（热稳定）	200 rxns
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PCR反应体系与反应条件
PCR（聚合酶链反应）在遗传学、生物医学和生物工程等领域具有广泛的应用。PCR反应体系是指所有反应组分的配比和浓度，而PCR反应条件则包括温度、时间和核酸扩增的循环数等因素。正确选择和优化PCR反应体系与反应条件，对于保证PCR反应的高效和可靠具有至关重要的意义。在下文中，我们将详细探讨PCR反应体系和反应条件的重要性，并介绍一些常用的优化策略。
一、标准的PCR反应体系：
  10×扩增缓冲液 　 10ul
  4种dNTP混合物 　 各200umol/L
  引物     各10～100pmol
  模板DNA  0.1～2ug
   Taq DNA聚合酶 　 2.5u
  Mg2+ 1.5mmol/L
  加双或三蒸水至  100ul。
qPCR试剂-PCR扩增试剂盒--细胞转染试剂-生物试剂采购平台二、PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
　　引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC尽量随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
　　酶及其浓度　目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
分子生物学试剂采购三、PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
实验室试剂采购平台

长长的路

普通做实验的话，最简单最靠谱的方法是仔细阅读说明书，人家说明书上写的很细，很多情况都有涉及，你再根据自己的情况适当调整。如果是作pcr试剂研发的话就当我没说

队长是我

一般pcr体系中必备的几项是 引物 模板（DNA）mix(包含酶以及离子等) 和水。
首先是确定的总体积，可以选择10ul, 20ul, 50ul等。
其次是根据mix，算出总体积中mix使用的体积。
根据自己提取或者逆转录得到的DNA浓度，以及一次pcr反应所使用模板的量，计算出DNA的体积。
根据引物浓度以及引物使用的终浓度，计算出引物使用的量。
最后用总体积减去上面几部分的体积，得到的就是水的体积。

同花顺

TRIZOL 1000ML  
先加200ml用匀浆器进行搅碎组织块，后补上800ml
氯仿  200ml
二甲苯 200ml
乙醇不定
depc水不定