【实验指南】如何养出形态漂亮的细胞经验分享（四）

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如何才能培养出好看的细胞呢？细胞的外观与培养过程息息相关，不同的培养方法所培养出来的细胞外观各不相同，有些特别标准好看，有些长得奇形怪状，培养方法也需要不断地研究与探索，小编将自己十多年的培养经验给大家分享一下，大家可以多多交流

关于传代时消化的问题，可以这样说。对于需要消化传代的细胞，每一次的消化都是对这个细胞存活与否，状态好与不好最至关重要的考验。

很多同学都遇到过这个问题，自己养的细胞开始的几代长的还挺好的，可是穿过几代之后就发现自己的细胞不行了，状态越来越差劲了。对于这个问题，可以非常肯定地说，你的消化环节出问题了。每一次的消化都让细胞受到较大损伤，所以越长越差。

消化过程中，加入胰酶后，所有细胞都在被胰酶消化着，但是我们忽视了一个问题就是：细胞的生长状态是不一样的，每一个细胞的贴壁情况也是不一样的，有的贴壁牢固，有的贴壁没有那么牢固的，所以，让所有的细胞消化同样的时间对细胞是不公平的，他们受到了差别待遇当然会有脾气啊。。。我后来对消化的方法进行了改良。争取做到因材施教。我称之为“四步消化法”。（以难消化细胞为例）


                                                    RM-1消化前

四步消化法
1、首先不加胰酶，倒掉旧培养基加入少量新培养基洗1-2遍。（这是前奏，即为第一步，目的是将漂浮着的死细胞之类尽量洗掉。）

2、然后再加入少量新培养基直接吹打一遍，这一遍是把贴壁不牢固的细胞吹打下来。再用培养基洗一遍，两次所得悬液混合传入新瓶。（可以将这些传入新瓶培养，再与后面胰酶消化过的细胞对比观察看谁长的更好一点就知道该细胞对胰酶的敏感度了。）

3、吸干净瓶内剩余液体，加入0.3ml左右的胰酶润洗一遍，吸掉弃之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同时置于显微镜下观察，待细胞与细胞之间间隙明显的时候立即吸弃胰酶，加入新培养基开始吹打，吹打2-3遍后吸取悬液于试管或新瓶暂存。用2ml左右新培养基洗一遍与前面的混合。（也可以传入新瓶培养，与后面及前面的做对比。）

4、然后用新的胰酶加进瓶里继续消化剩余的贴壁牢固的细胞。继续镜下观察，待剩余细胞间隙明显，细胞独立开来的时候，吸掉胰酶，加入新培养基吹打。悬液传入新瓶培养（根据实际情况你自己把握）。


                                                   RM-1消化完成

对于特别难消化的细胞和对胰酶特别敏感的细胞的话，可以继续加第五步甚至第六步。为了细胞更好的状态，更漂亮的样子，必须分多批多次消化，这样才能最大限度地将胰酶对细胞的损伤降到最低，保证细胞的状态能够最优。

当然了，如果细胞是属于那种很容易消化的细胞，像RAW264.7，仅仅第二步就搞定了。就没必要第三步第四步了。这个是需要你在实验中能够自己用心去体会的。建议你接受一个新细胞时把各步消化的细胞分别培养起来做比较，去摸索好细胞对胰酶的要求。便于你后续实验的开展。

将细胞消化分成这几步，除了是为了避免胰酶对细胞的损伤之外，还有一个更重要的作用就是，可以最大程度地把细胞吹打成单个单个的状态，不成片不连体。

因为细胞生长的时候肯定是要相互联系，大部分的细胞都是要成片生长的，尤其是对于贴壁细胞，单个细胞贴壁之后长着长着就长到一片去了。但是如果是成片的细胞抱团的话，传代后细胞是不能贴壁的，这样抱团的细胞就会死亡。所以，消化传代的时候一定要将细胞消化成单个单个的独立状态，这个非常考验实验人员的功夫的！


                                                     HELA消化前

细胞一旦脱落入悬液里你很难再将他吹打成单个，因为他没有受力点了。很难找到受力点让你对他吹打的力分散开细胞。所以必须要在细胞未脱落之前将其吹打开，受力点就是细胞贴壁的地方。这样就必须要严格控制好消化的程度啊，这和大师做饭掌握好火候是一样的道理啊。既要消化到容易吹打下来，又不能太过，一吹就整片脱落，要单个单个地往下掉。所以才要分批分次地加胰酶消化就是为了保证不同生长状态贴壁程度的细胞能够都维持在好的受力点分散开。这个是很重要的一点。尤其是对于一些细胞，这一点就是它的致命点，像Caco-2细胞就是如此。


                                                  HELA消化完成

另外关于传代很重要一点就是一定不能等到细胞长满的时候才去消化传代。要在细胞长到70%左右的时候就要传代了，一旦发现细胞生长中已经有叠层生长的时候就要立即进行消化传代，不能再拖了。

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