失败的新冠病毒，​基于核算扩增和侧流层析试纸的检测方法

乔帮主

如果我说新冠病毒并不是一种成功的病毒你可能不信？那就听我细细道来。要知道冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒及中东呼吸综合征和严重急性呼吸综合征等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒变异品种罢了。



看了比尔.布莱森的《人体简史》一书，我们会明白：新冠状病毒其实并不是一种成功的病毒。因为只有不擅长置人于死地又能广泛传播的病毒，才算是成功的病毒。这也就是为什么流感是一种常年不断的威胁。它能让患者在出现症状的前一天和康复后的一周内，具有强大的传染性，所以，每一个受害者，又同时是病毒的携带者和传播者。


比尔.布莱森在介绍道，一种疾病是否会成为流行病，取决于四个因素：它的致病性有多强；否擅长寻找新的受害者；控制它是容易还是困难；它对疫苗是否敏感。
每个人的身体表面，包括人体内部，都有着很多的病毒，从数量上估算的话，大约有380万亿个病毒。虽然在人类的印象中，提到病毒都会认为它是坏的，但是任何生物其实都有好坏之分，病毒也是一样。人体中绝大多数的病毒其实都是对我们无害的，它们的存在其实只是为了共生，而且作为回报，它们还会帮助人体维持健康。
虽然新冠病毒在病毒界并不成功，但是其危害却不容小视。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。



从生物科学角度分析，新冠病毒SARS-CoV-2（2019-nCoV）是一种RNA病毒。经典的检测RNA病毒的手段是逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。然而RT-PCR需要使用昂贵的实时荧光定量PCR仪器，同时需要专业人士操作，尚不是一种现场检测技术。而基于抗体的现场检测手段，特异性和灵敏度一般不及核酸检测方法，同时发展出高效价的抗体也需要数周乃至数月的时间，难以实现应急检测。



应用举例一：
2020年8月哈尔滨工程大学发表论文《Single-copy sensitive, field-deployable, and simultaneous dual-gene detection of SARS-CoV-2 RNA via modified RT–RPA》。



在本研究工作中，作者利用改良的RT-RPA法，即逆转录-聚合酶指数扩增（RT-ERA，reverse transcription-enzymatic recombinase amplification）技术，实现了对新冠病毒RNA的全程闭管、三十分钟无需热循环、可现场可居家的超灵敏度快速检测。该研究不仅能对新冠病毒进行检测，其检测方案也可以适用于以后可能爆发的其它RNA病毒检测技术。
该技术的第一步是将病毒RNA片段逆转录为cDNA以便于后续核酸扩增；接下来用恒温扩增的方式，搭配合适探针，进而实现对cDNA的指数扩增以及对扩增后的核酸产物的检测。检测结果既可以通过观察荧光，也可以用更为简便的试纸条读取方式呈现出最终的检测结果来。
应用举例二：
2021年华侨大学研究人员在Lab on chip发表论文：《A microfluidic-integrated lateral flow recombinase polymerase amplification (MI-IF-RPA) assay for rapid COVID-19 detection》，文章提出了一种新型的RT-RPA法，做到了对于抗原抗体检测方法与核酸检测方法的很好平衡。灵敏度比抗原抗体高，易用性和成本却比核酸检测法更容易让用户接受。



该方法的原理如下图所示，主要分为两个部分：左侧的核算处理与扩增部分，右侧的侧流层析试纸条来观察检测结果。



基于侧流层析技术制备的快检试纸即侧流层析试纸可用于现场快速检测小分子、蛋白和核酸等生物大分子以及微生物。此检测方法易于操作，成本低廉，检测结果肉眼可见，在临床诊断、环境监测和食品安全分析等领域已被广泛应用。
传统的侧流层析试纸由四个组成部分：样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，如下图所示：将这四个部分叠加于支撑底板上就构成了一个简易的侧流层析试纸条。样品垫为经过处理的纤维膜或玻璃棉，用于快速吸收待检样品，使其利用毛细管作用向结合垫方向侧向流动；结合垫为纤维膜或玻璃棉，吸附有标记的生物活性材料(如金标抗体)，它可与待检样品溶液里的检测靶标结合形成肉眼可见的免疫复合物；层析膜大都为硝酸纤维素膜(Nitrocellulose，NC膜)，它是侧流分析技术中的关键材料，为分析物之间的反应提供了平台，其上固定有两条或多条不同生物活性物质，喷印的检测线(Test Line，T线)和质控线(Control Line，C线)，用于拦截带标记的免疫复合物，并可直观地显示检测结果；吸水垫为吸水纸板，用于吸收流过层析膜的待检样品，以平衡层析膜两边的压差，促使更多待检样品在层析膜上侧向流动。



该方法的具体操作过程如下图所示：

1、RNA的核酸提取
2、样品的转移
3、核酸扩增
4、可视化读取检测结果



整个检测装置的加工如下图所示：该装置包含三层结构。
最上面一层，包含输入口，方便加样处理；
中间一层，是加工出来的不同腔体；
最下面一层，为了封装而存在的壳体。



整个实验的实物图如下所示：



总结：研究人员开发了一种结合侧流层析与检测核酸扩增检测的优秀杂合体。所设计的装置使用方便，非常值得肯定的新冠病毒检测产品。要知道，随着疫情持续蔓延全球，低成本快速检测装置在各大机场和车站需求旺盛，写字楼，学校这类场景也具有很大的应用价值。希望随着技术的发展，快速、标准、系统性的检测产品得到大家认可。
参考文献：A microfluidic-integrated lateral flow recombinase polymerase amplification (MI-IF-RPA) assay for rapid COVID-19 detection
DOI:10.1039/d0lc01222j

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