His-Tag重组蛋白亲和层析操作（介绍,所需材料,步骤,试剂）

空白派

一，His-Tag重组蛋白亲和层析简单介绍
如果表达的蛋白质含有6个His片段，并且镍离子附着在亲和吸附凝胶上，则蛋白质会特异性地与吸附凝胶结合，下面详细介绍His-Tag重组蛋白亲和层析标准操作规程。

<hr/>二，His-Tag重组蛋白亲和层析实验所需材料

His-Tag重组蛋白亲和层析实验材料
琼脂糖凝胶中镍亲和柱、紫外探测器、蛋白质电泳装置及配件，如夹子、玻璃板、灌封支架、缓冲罐等。、5毫升注射器
0.45μm过滤器、超声波干扰器
His-Tag重组蛋白亲和层析试剂：
1.结合缓冲液：20 mM Tris HCl，150 mM NaCl，10 mM咪唑，pH=8.0
2.洗脱缓冲液：20 mM Tris HCl，150 mM NaCl，不同浓度的咪唑，pH=8.0
3.20%乙醇
4.三蒸馏水
5.透析液：20 mM Tris HCl，1 mM EDTA，pH=8.0
注：纯化过程中使用的所有试剂都用三种蒸馏水定容。溶液制备后，用0.22μm滤膜过滤，并在4℃下保存。
在本实验中，可以先配制出相应pH值的高浓度母液，使用时稀释。例如：
（1） 1 M Tris HCl，pH=8.0
称取60.57 g Tris，溶于400 mL三蒸馏水中，充分溶解，调节pH值至8.0，加入三份蒸馏水，使其体积达到500 mL。用0.22μm滤膜过滤，并在4℃下保存在玻璃瓶中。
（2） 2.5 M NaCl，pH=8.0
称取36.53g氯化钠，溶于200ml三蒸馏水中，充分溶解，调节pH至8.0，加入三蒸馏水至250ml，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存于玻璃瓶中。
（3） 1 M咪唑，pH=8.0
称取咪唑17.02g，溶于200ml三份蒸馏水中，充分溶解，调节pH值至8.0，加入三份蒸馏水至250ml，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存于玻璃瓶中。
三，His-Tag重组蛋白亲和层析实验步骤
3.1 准备样品
将IPTG诱导的菌液以7000转/分离心10分钟，收集菌细胞，用PBS冲洗两次，再用纯化用的平衡液漂洗一次，最后在平衡液（35mL/g菌球）中重新悬浮，超声破碎收集的菌液至澄清，13000离心机转速10分钟，取上清液，用0.45μm过滤器过滤。
3.2 工艺过程
3.2.1准备
打开盖子后，在4℃下储存的试剂经超声脱气40分钟，并平衡至纯化温度。
3.2.2打包列
装填塔前，将三蒸馏水注入塔中，打开开关至最大流量，使三蒸馏水快速流过色谱柱，消除塔中的气泡。4℃时从冰箱中取出凝胶填充物，用吸管吸干上层20%乙醇，加入三份蒸馏水轻轻再悬浮，缓慢加入柱内，再注入三份蒸馏水，打开开关至最大流速，保持柱垂直，必要时使凝胶致密，你可以用注射器从出口轻轻吸出，给凝胶施加一定的负压，使凝胶更致密。3.2.3.平衡
提前打开紫外检测器，将波长调至280nm，灵敏度100%，预热。向色谱柱内注入结合缓冲液，打开开关，使液体以恒定速率（3ml/min）向下流动。此时，调整光量，使吸光度值稳定在100。此时，它被调整为满。吸光度稳定后，将灵敏度调整到0.5A/0.2A，使吸光度稳定在0。此时，是基线调整。
3.2.4.加载
在预处理样品中加入20mM咪唑，有时根据不同蛋白质特性增加样品中咪唑的浓度，以减少非特异性结合。沿墙慢慢加入柱内，以防产生气泡。打开开关，使流速尽可能低（1ml/min）。当吸光度值大于20时，用50毫升离心管连接流出的蛋白质溶液并称其流过。流经的蛋白质应该是不与凝胶结合的细菌蛋白质。
3.2.5.洗涤
沿壁面缓慢加入结合缓冲液，打开开关，以3ml/min的流速取大于10个柱体积的结合缓冲液，使吸光度恢复到基线或接近基线水平。
3.2.6.洗脱
对于一种新的重组蛋白的初始纯化，一般选择40mm、60mm、80mm咪唑作为流动洗涤浓度，主要洗脱凝胶中的非特异结合细菌蛋白，以100mm、200mm、300mm咪唑为洗脱剂。浓度主要洗脱靶蛋白，500mm咪唑洗脱顽固结合在凝胶上的蛋白质。对每个洗脱浓度的蛋白质进行SDS电泳检测，确定洗脱杂质蛋白和目标蛋白的最佳浓度作为后续洗脱条件。在每个洗涤浓度（关）下，吸光度值必须达到稳定的最小值。一般使用与流动洗涤一样多的洗涤液。
3.2.7.平衡
在最终洗脱后，添加结合缓冲液，直到吸光度平衡基线或接近基线水平。
3.2.8.保存
缓慢地向柱中加入5倍凝胶体积的20%乙醇，使凝胶完全浸入乙醇中。最后，缓慢地在乙醇中重新悬浮凝胶，取出并放置在干净的离心管中，用乙醇冲洗柱几次，以尽量减少凝胶的损失。记录使用情况，并将凝胶保存在4°C。
3.2.9.透析
（1） 将保存在4°C的透析袋从水中（用于煮沸透析袋的去离子水）中取出，戴上一次性手套，取出水，折叠一端，用密封夹密封。透析液渗漏试验。
（2） 倒出透析液，将不同梯度洗脱的蛋白质加入透析袋中，折叠上口，用密封夹密封。检查有无渗漏后，放入2L透析液中。
（3） 用玻璃棒将透析袋固定在烧杯内，防止透析袋随透析液旋转而影响透析效果。4℃透析，2小时后更换透析液，透析过夜。
3.2.10.电泳检测
装载、流动、洗涤、梯度洗脱蛋白各20μL，加入等量的2×SDS缓冲液，在沸水中煮沸8分钟，进行SDS-PAGE电泳检测。常温过夜染色，为避免染色过程中污染，染色液只回收一次。
4.蛋白质浓度测定
每一种纯化的蛋白质在储存前必须经过处理
蛋白质浓度测定方法如下：
取5毫升考马斯亮蓝G-250在试管中，加入100μl 0.9% NaCl的空白对照，加入适量的待测组（直到考马斯亮蓝G-250转为棕红色至蓝色）的未知蛋白，用0.9%配制100μl的NaCl，搅拌均匀，静置5分钟，测定吸光度595。用721分光光度计（需预热20分钟）（玻璃比色皿，空白对照调为0），进入标准曲线，得到蛋白质浓度。制作标签并在-20°C下储存。5.浓缩蛋白
如果纯化后的蛋白质浓度过低，用超滤杯或硫酸铵沉淀法浓缩后再测定浓度。
1超滤杯的使用
使用前用三杯蒸馏水冲洗超滤杯三次，然后将三杯蒸馏水加入超滤杯中，以3000转/分离心10分钟，以彻底清洗滤膜。倒出三份蒸馏水，加入待浓缩的蛋白质样品，离心转速3000转/分，达到要求体积后停止离心，取出浓缩蛋白样品进行电泳检测和蛋白质浓度测定。超滤杯在使用前用三次蒸馏水冲洗三次。加入三杯蒸馏水，以3000转/分的速度离心10分钟。最后加入20%乙醇，将滤膜浸入乙醇中并在4℃下保存。
2硫酸铵沉淀法
将蛋白质溶液与饱和硫酸铵按1:1的比例混合，置于4°C下30分钟，以13000 rpm离心10分钟，丢弃上清液，用500μL PBS溶解沉淀的蛋白质（PBS的量可根据沉淀量适当增加）。溶解后，透析液用于透析。
<hr/>三，His-Tag重组蛋白亲和层析注意事项
1在4°C下储存的纯化液每次使用前必须脱气40分钟，以防止在纯化过程中凝胶进入。
2加载前，应使用0.45μm过滤器过滤样品。
3每种蛋白质都有其独特的特性。如果缓冲液中的任何条件（pH值、盐离子组成、盐离子浓度）不合适，则蛋白质沉淀缓冲液中各组分的浓度都不是恒定的。可根据不同蛋白质的特性进行适当调整.




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