多糖分离纯化—离子交换层析和柱层析

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多糖同蛋白质一样，对生物体有着重要的生理功能和体外活性，其结构是决定其性质和功能的前提。多糖的分离纯化是后续解析结构的关键程序，其中使用比较多的为离子交换层析，凝胶层析等。
离子交换柱层析

离子交换层析在多糖的分离纯化中应用广泛，根据多糖的性质，常使用阳离子交换剂、阴离子交换剂以及硼砂交换剂（图1）。其中阴离子柱层析是最常用的方法，适用于分离酸性、中性和粘多糖，如如DEAE cellulose、DEAE Sephadex（葡聚糖）、DEAE Sepharose（琼脂糖）系列等。



图1.常用的柱子填料类型

以DEAE cellucose-52为列，它是一种阴离子交换柱，填料为二乙氨乙基纤维素，含有NH3或NH2功能基。适用于分离中性和酸性蛋白、多糖、核酸等物质，也适用于植物提取。它的分离纯化原理如图2所示，阴离子色谱柱填料颗粒上带有正电荷，混合的粗多糖样品上样之后，其中的阴离子多糖（酸性多糖，如果胶以及其他的植物性多糖等）由于含有和填料相反的电荷，则由于静电作用与填料结合，而其他类型的多糖（如中性多糖）则不与填料结合，此时用不同浓度的盐溶液洗脱（如NaCl），则中性糖先洗脱出来，阴离子多糖后洗脱出来。将洗脱液收集（根据柱子的装载量及上样量，可选择合适的管数及每管的体积，一般可3mL/管，洗脱100管）；采用苯酚硫酸法检测洗脱液中的糖含量，可每隔2管检测一次，根据管数和吸光度（OD490）绘制洗脱曲线，手机吸光度大于0.3的部分。



图2. 阴离子柱层析的主要原理

凝胶柱层析

而凝胶层析主要是根据分子量对样品进一步纯化，其原理是基于分子筛，如图3所示。在分离的过程中，分子量大的先流出，而分子量小的后流出。根据绘制的洗脱曲线即可收集不同分子量的样品。在分离寡糖时，一般采用孔径较小的凝胶填料进行分离，如Sephadex G-15，Sephadex G-25，Bio-Gel P-2 ，Bio-Gel P-4 等；而分子量较大的多糖一般采用Sephadex G-100和Sephadex G-200等。



图3 凝胶柱层析的主要原理

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