ELISA实验分类及其原理

乔帮主

ELISA是酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的简称，是继免疫荧光及放射免疫技术后，迅速发展而来的一种免疫酶技术，目前已被广泛应用于生物学、医学科学等多种研究领域。
ELISA基本原理
利用抗原抗体的特异性反应原理。将抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
实验时，需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上，通过检测分子（酶或荧光基团），将化学信号转换为电信号，以OD值或发光值的结果，对靶蛋白进行定量分析。
ELISA的分类
ELISA可同时用于测定抗原和抗体。根据ELISA实验原理及操作的不同，可以将ELISA大致分为四种：直接法、间接法、夹心法和竞争法。


直接法（Direct ELISA）
原理：将抗原或抗体固定于酶标板上，然后用酶标抗体或抗原直接检测。
直接法将抗原或抗体固定到酶标板上，用带有酶标记的一级抗体或一级抗原，与之特异性结合，再利用酶催化底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。
优点：实验步骤少；检测速度快；不需要用到二抗，避免了交叉反应。
缺点：抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与酶标板结合，实验背景会比较高；每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活；另外，由于没有二抗进行信号放大，降低了测定的灵敏度；并且，检测对象有限，只能测定酶直标的分子，也是此法的局限。
间接法（Indirect ELISA）
原理：将抗原或抗体固定于酶标板上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体或抗原进行特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。
间接法常用于检测抗体。将抗原固定到酶标板上，加入一抗，与抗原特异性结合，再加入带有酶标记的二抗，使二抗与一抗特异性结合，最后加入底物，使底物与酶反应显色，即可测定总靶标蛋白的含量。
优点：使用酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济，并具备更大的灵活性。
缺点：存在交叉反应的可能性（酶标二抗与待测样本结合），可能会增加背景；与直接法相比，多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。
夹心法（Sandwich ELISA）
夹心法分为双抗体夹心法和双抗原夹心法。
双抗体夹心法：此方法常用于检测抗原。将抗体固定在固相载体上，加入待测抗原，与抗体特异性结合，再加入酶标抗体检测，并利用底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。
双抗原夹心法：反应模式与双抗体夹心法类似，用固相抗原和酶标特异性抗原，分别代替固相抗体和酶标特异性抗体，即可测定样品中的抗体。
夹心法ELISA的显色结果与待检抗原（或抗体）的量成正比。
优点：灵敏度和特异性高；抗原无须事先纯化。
缺点：适用于检测具有两个以上识别位点的大分子蛋白；对配对抗体要求高。
竞争法（Competitive ELISA）
原理：样本中的抗原及预包被的酶标抗原，竞争性地与固相抗体相结合。样本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原就越少，最终显色也越浅。需要注意的是，显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。
预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体。实验时，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原与预先包被在固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体；如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色。
竞争法显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比，且适用于测定只有一个识别位点的小分子物质。
优点：可检测不纯的样品，数据再现性高。
缺点：存在整体敏感性和专一性较差的问题。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/606440130