生化分析仪原理

青草

不同于血细胞分析仪测试血液中的有形成分血细胞（“什么是血常规 什么是三分类、五分类，为什么有了血细胞分析仪还要流式细胞仪？”），生化分析仪主要测试血液中的液体的血清/血浆（“IVD仪器检测的全血、血浆、血清是什么？”）中游离的物质。
如下图是一张典型的生化分析的检验报告。



以肝脏功能（肝功）项目中的丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)为例，在各种病毒性肝炎的急性期、药物中毒性肝细胞坏死时，ALT会大量释放入血液中,其在血液中浓度会明显增高，所以检测ALT在血液中的浓度，可反应肝功能是否受到损害。
其他物质在血液中的浓度，也都有相应的、不同的临床意义。
今天简单介绍一下生化分析仪的工作原理。
先来看一下生化分析仪原理的“简洁版”介绍。生化分析仪的理论基础是朗伯-比尔定律。即当一束平行的单色光垂直通过某一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，其吸光度(A)与溶液液层厚度(b)和浓度(c)的乘积成正比。即：  



其中，
K：吸光系数，单位L/(g·cm)
A：吸光度，






那么想知道血清中某种物质X的浓度c，就把血清装在一个已知内腔宽度b的容器中（那么相应液层厚度b就知道了），然后用平行单色光照射，再测出入射光强度I0和透射光强度It，再想办法知道物质X的吸光系数K，就可计算出血清中物质X的浓度：



到这为止，“简洁版”的生化分析仪工作原理就结束了。
但我们来看一下这个“简洁版”的原理介绍，存在哪些问题。  
1.吸光度系数K从何而来？或者说仪器只能通过光电探测器（将光信号转换成电信号的传感器）测出光强度，怎样转换成物质浓度呢？
这就引入了定标或校准的概念。现在通过朗伯-比尔定律，可以知道浓度c和吸光度A之间是差了一个系数，那就想办法把它测试出来。这个过程就称为定标或校准。
基本的原理，就是用一系列的、已知浓度（C1、C2、C3……）的标准物质，在仪器上测试，得出其对应的吸光度值（A1、A2、A3……），然后拟合一条浓度值A和吸光度值C的关系曲线。被测物质的吸光度值Ax，代入拟合曲线，就能得到一个对应的浓度Cx。



许多物质的溶液显现出颜色，例如KMnO4溶液呈紫红色，邻二氮菲亚铁络合物的溶液呈红色等等，而且溶液颜色的深浅往往与物质的浓度有关，溶液浓度越大，颜色越深，而浓度越小，颜色越浅。历史上，人们用肉眼来观察溶液颜色的深浅来测定物质浓度，建立了“比色分析法”，即“目视比色法”。  
那么定标，就相当于肉眼观察时，有一张标准色卡，标准色卡写明了每种颜色所对应的浓度。目测溶液颜色，和标准色卡一对照，就能定量溶液物质浓度了。



但朗伯-比尔定律成立，需要很严格的前提条件，如下：
1.入射光为平行单色光且垂直照射；
2.吸光物质为均匀非散射体系；
3.吸光质点之间无相互作用；  
4.辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象发生。
如果前提条件不符合，或者其他一些因素，标准曲会出现非线性的情况。如下面一些校准曲线。



那么就需要根据实际测试结果，进行校准曲线拟合。拟合之后，就能通过已知的吸光度Ax，在曲线上找到对应的样品浓度Cx了。
当然这里讲的定标或校准的概念，只是一个直观的理解。实际上牵涉到一些列的定标算法，也涉及校准品的制造等问题。由于篇幅原因，我们以后再讲。
吸光度系数K（或摩尔吸光系数ε），和物质种类、温度、入射光波长都有关系。为了保证校准曲线可用，就要控制前面几个参数。在一次测试中，物质种类是确定的，反应杯的温度就需要进行恒温控制，这就是生化分析仪中有温控系统的一个原因。而入射光波长就引出了我们下一个问题。
2.使用哪种波长的单色光照射被测物质？单色光如何实现？如何测量入射光强度I0和透射光强度It？
不同的物质，对不同的波长的光的吸收度是不同的。
如下图重铬酸根对350nm的光，吸光度最高；而高锰酸根对525nm光吸光度最高。



而同一物质，不同浓度的溶液，最大吸光度发生的波长是一致的，曲线上是相似的。  



在物质的最大吸光度的波段，同一物质不同浓度的吸光度差异最明显，如上图中，高猛酸钾溶液在525nm波长的光下，吸光度差异最明显，不同浓度间的吸光曲线拉的最开。
那么为了获得更好的分辨率、更好的区分浓度差异，往往采用最大吸光度的波长的光，来照射物质溶液。这就决定了选择哪种波长的单色光来照射不同的物质。
那么单色光如何实现呢？单色光的生成，首先需要光源，生化上常用的光源就是卤素灯和氙灯。光源需要冷却，因为过高的温度会加速卤素灯泡的老化，从而缩短其使用寿命。所以光源同样要进行温控，这是生化分析一种需要温控系统的另一个原因。  
而光源是面光源，需要透镜组将光源的发出的光聚焦到比色杯中心这一点上，或者形成稳定的线光源。从而去接近朗伯-比尔定律中的平行光条件要求。同时光源中的红外部分的光，也需要过滤掉，避免造成比色皿的温升。
但光源出来的光，仍然是各个波长混合在一起的复合光。前面我们讲了，我们需要探测物质在特定某个单色光下的吸光度，而不是测复合光的吸光度。那就需要分光，分出某个波长的单色光。
分光一般分为前分光、后分光。
所谓前分光，就是把光源出来的光，在照射到比色皿上之前，就分离成单色光。一种典型的方式是，让复合光通过滤光片（只能通过特定波段的光，滤除其他波段的光），将光变成单色。
比如下面这个滤光片的只让625~675nm波长的光通过。注意滤光片透光率曲线中，纵坐标是透光率T，T=0时，代表这个波长的光无法透过镜片，就是滤光片对这个波长的光的吸光度A无穷大。T=100%时，代表这个波长的光可以完全透过镜片，也就是滤光片对这个波长的光的吸光度A是0。  









当然，绝对的某一个点波长的“单色光”，通过滤光片是很难实现的。  
通过滤光片得到的单色光束，首先照射分光镜上，分光镜可以让光50%透过，50%反射。反射的一半光被光电探测器（将光信号转化为电信号）进行光强检测，就得到了入射光强度参照

。透过的一半光照射并穿过比色皿，检测出的穿过比色皿之后的光强就是透射光强度

。从而能计算出吸光度A。



上图3 Filter wheel的结构如下，通过转动，而实现不同波长的光照射到比色皿上，以分析不同的物质。  





所谓后分光，是让光源出来的复合光，直接照射到比色皿上，然后将透过比色皿的光分离成单色光进行分析。所以前、后分光，是指在比色皿前还是后将光分成单色光进行分析。
后分光一种比较典型方案，是通过光栅将透过比色皿的复合光，分成不同波长的单色光，打到不同的光电探测器上，然后分析所关注的波长的光的强度，作为透射光强度

。而入射光强度

，则以空白对照所得的光强度为准。空白对照或空白调零，认为这种状态比色皿的吸光度A=0，或这种状态可依据吸光度的加合性（总吸光度等于吸收介质内各吸光物质吸光度的总和，A总=A1 +A2+A3+……），来消除比色皿对光的吸收和反射，除被测物质外的其他物质、溶剂、试剂对光的吸收等。  





  






后分光也有采用滤光片的方案，如下图。  





  



单色光是否可以用激光或者LED？当然可以，但是不同物质的主吸收光波长是不同的。激光器或LED可以产生单色，但一个激光器，只有一个波长。测不同物质需要不同波长，比如一些生化是12个波长、16个波长等，那就需要多个激光器或多个LED来测不同物质。激光器和LED这两种光源的价格都很高，尤其是激光器的价格非常昂贵。和100多块钱的卤素灯比，就没有优势了。
三棱镜也可以将复合光分解成各个波长的单色光。但三棱镜分出的光，均匀性不如光栅好，不利于光电二极管阵列的探测。  


  






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