qPCR实验复孔重复性差？分析与建议

生物科研实验室

qPCR实验中通常会遇到复孔间重复性差的情况，一般有以下两种：
     一、CT值很大，如CT≥30，重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导至复孔间的CT值差异较大。解决方法为如果融解曲线没有杂峰，无模板阴性对照同目的基因的△CT值为3 or 5以上，那CT值为准确的，可多设置几个复孔，选择重复性好的CT值参与计算。     二、CT＜30，重复性较差。这种情况一般同操作有关。可从以下几个方面进行排查：     1 加样准确度：避免小体积加样，减少加样误差。可以将引物、SYBR Green Mix、ddH2O配置成混合体系，并且增加模板的稀释梯度，大体积加样。如：原液cDNA添加1μl，可以更改为原液cDNA稀释5倍，添加5μl，使用ddH2O补齐体系至20μl即可。     2 SYBR Green Mix、配置的混合体系需要混合均匀。从-20℃冰箱拿出的试剂需要完全融化并上下颠倒彻底混匀；配置体系时，将混在一起的Mix用移液器吹打混匀。     3 移液器吸取液体的准确度：移液器量程定期校准，校准周期为1年。购买与移液器配套的枪头，若枪头与移液器不匹配，在吸取液体时易出现漏气的现象，导至吸取量程不准确。在吸取相同量程的液体体积时，注意观察每次吸取液体在枪头内的液面高度是否一致。     4 定期校准qPCR仪：一般qPCR仪校准周期为一年。