如何看懂文献里那些图——流式细胞术

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流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球、细菌、小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术，被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。


如上图所示：细胞悬液在通过流式细胞仪时，一次仅可通过一个细胞，那么机器是怎么分辨不同细胞的呢？这也是我们理解流式细胞图的关键。
在多种类型的实验数据图中，最让小白们懵圈的，当属流式细胞图。在解读之前，我们先来了解一个概念：流式通道。
流式通道主要可以分为散射光通道和荧光通道：散射光通道有两个，包括FSC通道和SSC通道，而不同型号的流式细胞仪其荧光通道的多少差异较大，有的甚至没有荧光通道。
1. 散射光通道
FSC，即前向角散射，它的值代表细胞的大小。细胞体积越大，其FSC值就越大。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。
SSC，即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度（与细胞中所含的细胞器、细胞核等的数量成正比）。细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。
当细胞通过激光束时，检测器会检测到细胞或颗粒的散射光，放置在前面的检测器检测FSC，而放置在侧面的多个检测器检测SSC。这样我们得到的就是细胞的物理特征，根据其物理特征进行分群分类。
2. 荧光通道
荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征，而是其化学特征。如需要检测样品中是否有细胞表达某一CD分子，就将这一CD分子的抗体与特定的荧光素偶联，这种荧光素通过荧光通道时会被激发而产生荧光。这样该抗体与被检细胞结合后，就可以被识别到，我们也就能得到就能得到该样品中是否有细胞表达该CD分子（即区分阳性细胞和阴性细胞），以及有多少比例的细胞表达该CD分子等信息。


荧光通道接收到的信号越强，表示细胞上结合的荧光素越多，那么细胞表面表达的该CD分子就越多，因此可根据荧光信号的强弱判断细胞表达该CD分子的相对数量。总之，荧光通道值反映接收到的荧光信号的强弱，从而反映细胞上结合的荧光素的量，进一步反映细胞上表达该CD分子的量，最后间接反映细胞表达某CD分子这一化学特征。
了解了这个概念后，我们就可以很容易的看懂流式细胞图在表达什么。流式图最常用的是直方图和散点图，还有一种等高线图。
流式细胞图
单参数图（又称直方图）
横坐标代表荧光信号或散射光信号的相对强度，可以是线性或对数坐标；一般是相对细胞数。直方图的展示方式与平日所接触的大部分数据表示方式大致相同，理解上较为直观，但当需要比较不同标记之间的表达量或是所检测的细胞在一个细胞群体中所占的比例特别少时，则遇到瓶颈，不得不转向散点图。


如图即为单参数图，纵坐标为细胞数，横坐标为该参数的荧光信号/散射光信号的相对强度，向正方向增大。图中参数为IL-17+（白细胞介素17阳性）。
要注意，单参数图横坐标有时为线性表示(即按照比例)，有时为对数表示，图中为对数表示，每小格相差10^n-10^(n-1)。
散点图
散点图十分利于两参数图，而两个参数分别分布在x轴和y轴上，并且细胞计数以密度（点）图或轮廓图的形式显示，可显示其频率分布，同时也可以不同的颜色以标识给定位置的单元格密度。当用象限标记将散点图分为四个部分时，在直方图理解的基础上，可知右上象限表示荧光标记均为阳性或双阳性细胞，而左下象限则恰恰是显示两个标记均为负的细胞，左上象限和右下象限则分别代表只对y轴参数或x轴参数标记为正的细胞。


如图即为双参数图（散点图），两个参数分别为CD4+、CD3+，图中不同颜色为不同荧光染料染色的细胞。
在此引入一个概念——“门（gate)”/“设门”：说白了就是框定一个区域的细胞，让计算机帮你分析该区域。图中的十字称为“十字线”，用来分群，而非我们所说的“设门”。


上图为“设门”的例子，左下方的单参数图中圈定了一块区域，这块区域为淋巴细胞，则在右边的双参数图中就只显示淋巴细胞。（对比左列两图，对比右列两图）
等高线图
与散点图相类似，等高线图也可以代表两个通道的信息，但其优势在于可以更直观地体现细胞的密度，与地理上的等高线图做类比，地理上，等高线表示海拔高度，越密集则代表海拔变化越快，类似的，流式细胞图里的等高线越密集则表示细胞数目密度的变化越快。


流式等高线图的意义和实际应用与流式散点图较为相似，可以看作是流式散点图的一个变体。相比之下，流式散点图更为直观，所以应用也更为广泛。当然，流式等高线图也有其自身的优点，它较能直观地体现细胞群的集中点，等密度环线的中央区域代表一个细胞群的集中点，一般代表一个细胞群，所以在某些情况下，流式等高线图比流式散点图更能直观地体现细胞的分群。
<hr/>  文章来源于江莱生物（shjianglai666）



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