技术 | 一文读懂化学发光免疫测定

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来源：知乎


1、简介
近年来，化学发光免疫测定（CLIA）因其灵敏度高、特异性好、应用范围广、设备简单、线性范围宽等特点，在生命科学、临床诊断、环境监测、食品安全和药物分析等不同领域得到越来越多的关注。传统的免疫测定总是需要很长的孵化时间，这又导致整个分析需要几个小时才能完成，所以产量和应用范围在很大程度上受到限制。研究人员设计了不同的方法，通过改善质量运输和反应动力学来缩短分析时间。免疫测定扩大了CLIA的应用范围。
与第三代EIA相比，化学发光免疫测定通常被认为是第四代测定法。这是因为CLIA的灵敏度明显提高，信噪比高。
2、什么是化学发光法？
“化学发光”一词是由Eilhardt Weidemann（1888年）首次提出的。化学发光，是指当外源性反应的振子兴奋产物松弛到其基态并发射光子时所观察到的现象，可以用简单的术语来定义：发出光的化学反应。化学反应产生足够的能量（蓝光发射约300 kJ/mol，红光发射约150 kJ/mol），以诱导电子从其基态过渡到激发电子态。这种电子转换往往伴随着分子的振动和旋转变化。
在有机分子中，最经常遇到的是从π键轨道到π*反键轨道（π→π*）或从非键轨道到反键轨道（n→π*）的转变。因此，电子返回基态并发射光子被称为化学发光。被激发的分子也可以通过发生化学反应、碰撞失活、内部转换或系统间交叉而失去能量。从分析的角度来看，这些辐射较少的过程是不可取的，因为它们与化学发光竞争（见下图）。


当两个分子发生化学反应，从而有能量释放时（放热反应），这种能量有时不是表现为热，而是表现为光。这是因为能量激发了它所流入的产物分子。处于这种激发状态的分子要么放松到基态，直接发光，要么将其能量转移到第二个分子，后者成为发光体。这个过程被称为化学发光（见下图）。


3、化学发光免疫测定（CLIA）的原理
在抗原和抗体存在的情况下，抗体的结合区与抗原的表位结合，形成抗原-抗体或免疫复合物。通过使用标记的抗体来估计这种免疫复合物的水平是CLIA的基础。它涉及使用涂有感兴趣的抗原或抗体的固定固体相。这导致了光的产生，其强度与存在的标记复合物的数量成正比，并间接地帮助对感兴趣的分析物进行量化。光的强度是以相对光单位（RLU）来衡量的（见下图）。


这项技术的主要优势包括灵敏度和不受背景信号影响的能力。另外，根据这一原理工作的分析仪在设计和操作上都很简单。
4、化学发光免疫测定（CLIA）的基本组件和要求
CLIA反应的基本组件和要求有：
4.1、固相载体
包括Ag-Ab在内的所有反应和所有后续反应（直到产生光）发生的地方。

• 在CL反应中发出的光是各向同性的--它在所有方向上的发射是相同的。如果CL反应是在透明板的孔中进行的，那么光不仅向检测器的方向垂直辐射，而且还向其他孔横向辐射。光线很容易通过平板材料本身传播，这种现象被称为光管道。由于这个原因，CLIA绝不应该在透明板中进行。相反，必须使用不透明的平板。有两种不透明的平板可供选择。黑色和白色。使用黑板时，由于光的吸收，信号通常会减少10倍。
  最好的选择是使用具有均匀不透明度的白色板。最近的一个突破是在反应单元之间尽量减少光管道和由此产生的串扰，在反应单元上涂上一层钛。钛，具有复杂的网状工作结构，可以大大减少光管道和串扰（见下图）。
  

• 固体相必须允许有效吸附Ag或Ab作为捕获物。
  
• 最佳的捕获浓度是至关重要的。防止钩子效应并确保灵敏度。
  
• 捕获的高特异性可以防止假阳性。
  

4.2、信号试剂
信号试剂是实际的化学发光化合物（例如：鲁米诺、1, 2-二氧杂环丁烷、吖啶酯）。被示踪剂中的酶氧化后产生光。（可能需要有额外的分子如H2O2的存在）。信号试剂必须有这些化合物的组合：

• 产生光的Cl-底物Luminol I 1, 2-dioxetane（如果使用luminol还需要H2O2）。
  
• 增强剂以提高产生的光的高度。
  

4.3、CLIA底物
这是决定CLIA效力的一个关键因素。CL-底物在被标记为示踪剂的酶氧化后会产生光。光的产生量取决于所用底物的种类。有几种CL底物可供选择。我们来看看两种广泛使用的CL底物和其中涉及的反应：
4.3.1、鲁米诺
在基于鲁米诺的检测中，氧化剂（OX：H2O2）和发光材料（LEM：鲁米诺）在所需的pH值下在液相中混合。在H2O2的存在下，鲁米诺被氧化并在过氧化物酶的作用下分解成中间化合物-I。中间化合物-I与增强剂（lodophenol化合物是强增强剂，可使鲁米诺的CL增强1000倍）反应，生成中间化合物-II，后者又转化为3-氨基邻苯二甲酸二元体，同时发出光。
4.3.2、H2O2促进剂


在这个步骤中产生的信号越高（CL中的光），灵敏度就越高。但是，信号的增加不应伴随着噪声（NSB）的增加。鉴别性的测量可以增加结果的准确性。理想情况下，信号要稳定10-15分钟。
4.4、增强剂
增强剂是一种分子，加入后可使光输出增加几个数量级。例如，HRPO在H2O2存在的情况下，会导致鲁米诺的氧化，并发出光。在4-碘苯酚的存在下，这种光输出增加了1000倍以上。大多数增强剂是取代的苯酚和萘酚。
4.4.1、增强剂提高了信噪比
增强的CL是一种发光，而不是持续数小时的闪光，尽管通常在10-15分钟内就能读到。增强剂的例子有洛神花酚，吩噻嗪等。
4.4.2、发光是CL反应的最终结果
CL反应的最终结果是光。所有CL反应的强度通常很高（因为使用了增强剂）。根据光的持续时间，CL可以有两种类型：

• ‘闪光’型，即加入试剂后立即发光，持续时间为几毫秒。
  
• ‘发光’型，即光的发射慢慢增加，在相当长的孵化时间后达到最大值。
  

5、测量发光值
光由数十亿个微小的能量包组成，称为光子。从反应中发出的光或光子需要被测量或计数。来自CL反应的光是由仪器测量的。
发光仪。光度计的选择取决于所需的动态范围、灵敏度、复现性、温度控制、用于数据分析的板载软件。
所有的CL检测系统由以下部分组成：
5.1、样品室

• 将发光样品提交给检测器以测量光的数量。
  
• 必须与环境光密封，以减少潜在的干扰。
  
• 必须尽可能靠近检测器，以使可选的效率最大化。
  

（高效率是可选的信噪比的理想选择，它允许快速、精确的测量）。
5.2、探测器
光电倍增管（或称PMT）是一种多功能的设备，提供极高的灵敏度和超快的响应。非典型的光电倍增管由一个光发射阴极（光阴极）组成，然后是聚焦电极、电子倍增器和电子收集器（阳极），位于真空管中。
当光进入光电阴极时，光电阴极向真空中发射光电子。这些光电子然后被聚焦电极电压导向电子倍增器，在那里，电子通过二次发射的过程被倍增。倍增的电子被阳极收集作为输出信号。
由于二次发射倍增，在目前用于检测紫外线、可见光和近红外区域辐射能量的光敏器件中，光电倍增管具有极高的灵敏度和特别低的噪声。光电倍增管还具有快速的时间响应、低噪音和大面积光敏区的选择。
本节介绍了光电倍增管结构的主要特点和基本操作特性。


图 | 光电倍增管模型
进入PMT的光通过以下过程引起输出信号的过程：

• 光（光子）通过输入窗口进入并撞击光电阴极。
  
• 光阴极向真空中发射光电子（由于光电效应）。光阴极通常被保持在一个非常高的负电压下，通常是-500到-1500伏。
  
• 这些光电子然后被聚焦电极电压引向电子倍增器（dynodes），在那里电子通过二次发射的过程被倍增（通常是106到107）。这种二次发射在每个二次发射过程中都会重复。这种二次发射在每一个连续的动态节点上重复进行。
  
• 从最后一个阳极发射出来的倍增电子被阳极收集。由于二次发射倍增，PMT提供了极高的灵敏度和极低的噪声。
  

光电倍增管通常有一个侧向或正向配置的光电阴极。侧向型通过玻璃球的侧面接收入射光线，而正面型则通过玻璃球的末端接收。正面型（或端面型）有一个半透明的光电阴极（透射型光电阴极）沉积在入口窗口的内表面。与具有反射模式光电阴极的侧向型相比，头向型提供了更好的空间均匀性。
正面型的其他特点包括可选择从几十平方毫米到几百平方厘米的感光区域。
具有大直径半球形窗口的迎面型变体已被开发出来，用于高能物理实验，其中良好的角光接受能力很重要。


图 | 外部外观


图 | 光电阴极类型
光电倍增管的卓越灵敏度（高电流放大和高信噪比）是由于使用了一个低噪声的电子倍增器，它通过一个级联二次电子发射过程放大电子。
5.3、信号处理方法和信号输出显示
在信号处理方法中，有必要强调两个非常关键的事实。

• 所有从光电阴极产生的电子都不会遵循相同的轨迹，并撞击到动力源上。有些可能会偏离，成为NSB的来源。
  
• 很多时候，由于辐射和宇宙射线，即使没有光落在PMT上，也会出现输出脉冲（暗电流）。这也是造成高NSB的原因。
  

6、化学发光法的优点
作为最好的检测技术，化学发光法有很多优点，让我们来了解一下：
6.1、灵敏度高
区分一种检测技术和另一种检测技术的最重要参数是分析灵敏度。众所周知，灵敏度越高，技术就越好。增强型化学发光技术比吸收光谱法的灵敏度高100,000倍，比荧光法的灵敏度高至少1000倍。
6.2、线性范围高
高线性范围在ELISA读取器中是有限的，因为它们不能读取高于3.0的OD.，因此不得不进行稀释。
在化学发光免疫测定中，较大浓度范围的样品可以在不稀释的情况下进行分析。化学发光在10-或10'的动态范围内提供线性测量。此外，CLIA中较高的动态范围增强了分辨率，使阳性和阴性之间的区分变得容易。这在传染病的诊断中特别有用，在这种情况下，阳性和阴性的区分对于正确的治疗是绝对必要的。
6.3、信噪比高
在化学发光法中，有更好的信号和噪音的区分。这可以通过使用增强剂、脉冲高度鉴别器和光子计数来实现。
6.4、简单
ECL作为一种分析工具的吸引力在于其检测的简单。光强度的测量相对简单，只需要一个光电倍增管或光电二极管和相关的电子装置来转换和记录信号。
6.5、复现性
化学发光检测是非常稳健和复现的。
6.6、无猝灭
荧光检测中会出现低于预期的量子产率。这种情况发生在大分子，如用荧光剂（FITC，荧光素）大量标记的抗体，被激发后，由于空间上非常接近，发生辐射的能量转移较少。另外，在水环境中，由于碰撞会发生淬灭。加入增强剂可将水从CL产生的部位排除，并提高发射效率。
6.7、没有内部过滤器效应
与荧光不同，在荧光中，只要使用的溶液吸收了少于2%的激发光，那么浓度和荧光发射之间的线性关系就成立，而在化学发光中，由于不需要流出的光，所以光发射和浓度之间的关系是线性的。
在荧光中，当溶液的吸光度增加到超过这个数量时，关系就变得非线性。这种效应被称为内部过滤器效应，是由于激发光被荧光体吸收后，激发强度在整个路径长度上的损失造成的。化学发光是没有这种误差的。
6.8、没有光散射效应
荧光测量中常见的瑞利和拉曼散射在化学发光中是看不到的，因为没有激发光源参与。
6.9、没有材料和溶剂的影响
在荧光测定中，含有紫外线吸收剂的石英玻璃和塑料材料可能会发出荧光并增加背景噪音。在化学发光中，这种可能性被完全消除了，因为光只来自于反应。
另外，一些溶剂如乙醇可以引起明显的荧光，但没有化学发光。
6.10、无光分解效应
由于使用强光源而导致的分析物的光分解，在常规和激光诱导的荧光测定中发生，不会发生化学发光。
6.11、不依赖氧气浓度
电化学发光，是化学发光的一个变种（其中电极表面的反应性物种从稳定的前体发出光），严重依赖氧气的可用性。该反应通常涉及与钌（II）三（双吡啶）和三肽胺的氧化-还原型反应。另一方面，化学发光对氧气的可用性没有这种依赖性，因为光的产生涉及到简单的单步反应。
6.12、没有假碱的形成
假碱的形成是电化学发光的一个固有的缺点，这是由所涉及的复杂化学反应决定的。另一方面，化学发光没有这种复杂的化学中间物的形成，因为所涉及的基本反应非常简单。另外，在系统中加入增强剂的灵活性并不影响整个Ag-Ab反应。
6.13、不容易受到干扰
当涉及到化学发光时，在荧光和电化学发光中观察到的高背景强度不是一个问题。无论杂散电子和环境中的辐射在PMT中产生什么样的小干扰，都可以通过适当使用脉冲高度辨别机制来解决，这是一个好的发光计。
6.14、更长的保质期
化学发光基质的保质期约为一年，而荧光基质（含有荧光分子）的保质期仅为一周。由于它提供了如此多的优势（已被许多科学研究证实），化学发光技术肯定比其他所有的检测技术更有优势。
7、CLIA的故障排除指南
7.1、阴性对照的RLU值过高

可能原因	纠正措施
阴性对照反应室的污染	洗涤时，不要让前一个反应室或阳性对照的孔溢出
阴性对照小瓶的污染	检查移液管中是否有残留液体或干物质。如果有，请清除每个样品使用新的吸头总是在阳性对照之前格式化阴性对照孔。用新鲜试剂重新运行
洗涤不充分	确保反应室被完全填充
洗涤缓冲液准备不正确或不是新鲜制备	用新制备的洗涤缓冲液重新进行检测检查用于制备洗涤缓冲液的蒸馏水的pH值

7.2、RLU值总体偏高

可能原因	纠正措施
洗涤步骤不充分	重复洗涤步骤。确保孔被完全填满，但不溢出
试剂污染	检查移液管中是否有残留的液体或干燥的物质。如果有，请清除检查移液器吸头是否足够长，以便在吸头顶部和桶体之间留有空气空间每个样品都要使用新的移液器吸头阴性对照孔的格式一定要在阳性对照孔之前用新的试剂重新操作
洗涤缓冲液准备不正确或缓冲液不是新鲜准备的	用新的洗涤液重新进行检测检查用于制备洗涤缓冲液的蒸馏水的pH值

7.3、阳性对照的RLU值低

可能原因	纠正措施
试剂不在室温下	确保所有试剂盒成分都在室温下（20 - 25℃）
测试量低	确保移液器吸头安装正确/紧固检查移液器桶是否有障碍物
基质A和B没有新鲜制备	立即准备好基质或准备不正确遵循工作试剂准备表。
信号试剂的污染	用新鲜试剂重新进行检测
孵化时间太短	检查定时器的校准记录孵化的时间
袋子里有水分	检查小袋中的干燥剂是否处于工作状态将小袋中未使用的孔密封起来在第一次打开小袋时要注明日期
孵化温度不当	检查孵化器温度/室温（20 - 25℃）
室温太低不适合	检查工作区域的孵化温度
洗涤步骤过于剧烈	降低清洗系统的压力
试剂使用前未混合	使用前混合试剂
测定开始后允许反应室干燥	不间断地完成所有化验步骤
准备工作液时加入的示踪剂浓度不足	准确制备结合物按照制造商描述的工作试剂制备方法

7.4、底物出现淡黄色或棕色的颜色

可能原因	纠正措施
底物被污染	使用新鲜的底物液

7.5、检测的复现性差

可能原因	纠正措施
加入的试剂量不正确	洗涤步骤不充分。确保手洗技术的一致性。如果使用自动洗板机，请定期进行维护，以确保机器正常运行并保持清洁
孵化温度	尽量保持一个稳定的环境，特别是在温度方面。请参考协议中的最佳反应条件
研究方案变化	确保尽可能地遵循书面研究方案，以限制可能由环境、设备和技术人员带来的变化
配药/移液错误不正确的清洗步骤	确保移液器吸头安装正确/紧密检查移液器桶是否有障碍物检查移液器的校确保所有的清洗设备正常工作，孔被完全填充，但不溢出。

7.6、边缘效应

可能原因	纠正措施
反应室提供不均匀的温度	保持反应容器周围环境一致，密切注意温度

7.7、测定漂移

可能原因	纠正措施
测定设置过程中的中断	测定的设置应该不受干扰，并在尽可能短的时间内完成，同时保持良好的技术。为了防止在设置检测时出现任何延误/中断，在开始之前准备好所有的试剂和样品
试剂/样品不在室温下	只有当所有的样品/试剂处于室温时才分配，以防止整个板孔的温度变化

7.8、自动化结果与手工方法不同

可能原因	纠正措施
自动化应用没有达到	检测的设置应该不受干扰，并在尽可能短的时间内完成，同时保持良好的技术。为了防止在设置检测时出现任何延误/中断，在开始前准备好所有的试剂和样品
试剂/样品不在室温下	只有当所有的样品/试剂都处于室温时，才能分配样品/试剂，以防止整个平板孔的温度变化

8、良好实验室技术的提示
8.1、光照反应板
浅色反应板是进行检测反应的平台，因此正确的反应板类型是至关重要的。在平板达到室温之前，不要打开和使用任何平板。一旦包装袋被打开，请注明日期，取出所需数量的条带，并将剩余的条带密封在注明日期的微孔板包装袋中。将条带放在正确的支架上，并放在一个水平的表面上，以便进行检测设置的其余步骤。应检查板条是否有任何缺陷。
8.2、微量移液
检测中使用的体积非常小，所以准确地校准移液器并按照制造商建议的时间框架进行校准是极其重要的。除了校准移液器外，还要确保使用特定移液器所需的正确吸头；吸头应持续吸取/分配相同的体积，并正确地安装在移液器的末端。为防止污染所使用的任何试剂，在分配不同的样品/试剂时应更换移液器吸头。进一步的预防措施是，在分装前，只需将所需的样品/试剂的量转移到一个单独的容器中。
8.3、洗涤
洗涤步骤是为了从含有结合成分的孔中除去多余的试剂。这个步骤可以手动完成，也可以使用自动洗板机。无论使用何种洗涤方法，最终结果都应该是一样的。洗涤液应淹没每个孔3-5次，每次洗涤之间应浸泡5-30秒，这取决于检测和使用的设备。在选择洗涤液的成分时要考虑很多因素，所以一定要遵循建议的制备方法。根据选择的洗涤方法，以下是一些需要考虑的额外事项。
手动：用相同体积的洗涤液填满每个反应孔，并保持每孔洗涤的时间相同。孔中不应有气泡，孔中不应有洗液溢出。
洗板机：对所需的清洗周期和浸泡时间进行编程，以实现可重复的清洗步骤。对洗板机进行定期维护，以确保准确的分配量和洗板头的清洁。
8.4、底物
在使用前一定要检查底物是否有颜色。信号的孵化时间是检测中的一个关键点，应根据协议中的规定保持时间限制。
8.5、读取环境
为确保结果的复现性，在稳定的环境下进行所有的检测。理想的稳定温度是一个几乎没有气流的环境。在热带或寒冷的气候条件下，建议实验室调节室温（20 -25 ℃）以确保适当的反应。振动/旋转也会影响测试，所以应避免这些振动。周围的环境并不是唯一值得关注的，板架中的直接环境也很关键。所有的平板、样品/对照品、结合物和其他试剂只能在室温下使用。这将最大限度地减少整个板块的温度变化。主要目标是尽可能地保持环境的稳定和一致。
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