将液体活检整合到癌症管理中

长长的路

2017年3月2日，Nature上发表了一篇题为《Integrating liquid biopsies into the management of cancer》的综述，意大利坎迪奥罗癌症研究所的研究人员讨论分析了如何利用各种形式的液体活检技术，来对患者进行治疗指导，并最终整合到临床应用中，而这其中最主要的就是如今在临床应用中最前沿的ctDNA技术。

肿瘤是由于控制细胞生存、生长、增殖和分化的基因中的突变发生累积导至的。如今，对肿瘤的分子图谱通常是从原发性肿瘤或单个转移病灶的组织DNA/RNA中获得的；随之确定的治疗策略也是根据组织的分子图谱确定的。

然而重要的是，肿瘤的分子图谱是随着时间动态演变的。肿瘤的这种对各种内源性和外源性选择压力的演变能力具有很多的影响：第一，个体肿瘤的遗传组成是呈高度异质性的；第二，单个患者的不同肿瘤转移病灶存在分子分型；第三，肿瘤细胞受治疗压力，尤其是靶向药物，会动态地改变肿瘤的遗传图谱。

人类血液样本中包含包括无细胞DNA（cfDNA）、RNA（cfRNA）、蛋白质、细胞、囊泡（如外泌体），这些成分可能来源于包括肿瘤在内的不同组织。事实上，肿瘤细胞的快速更新导至了肿瘤的核酸和囊泡的不断释放进入血液循环，活的肿瘤细胞也可以从肿瘤上分离并进入血液。因此，检测和特征化循环无细胞肿瘤DNA（ctDNA）、肿瘤RNA（主要是microRNA），和循环肿瘤细胞（CTCs）的技术，使得在临床上能够重复、无创地研究人类肿瘤的动态演变（图1）。通过抽血实现对实体肿瘤的分子图谱的探测的可能性对研究和治疗具有重要意义，这已经显著吸引了肿瘤圈的兴趣；而所谓的“液体活检”便常常被用来形容这一技术。

循环无细胞肿瘤DNA（ctDNA）已被证明与肿瘤信息相符，这在分子病理和临床肿瘤研究中有重要的应用价值。循环核酸分析，即现在常说的“液体活检”，能够被应用于检测治疗状况、评估抗药性和量化微小残留病灶。而除了血液以外，现在也能够从尿液、唾液、胸腔积液和脑脊液获得来源于肿瘤的遗传信息。通过循环肿瘤细胞检测（CTCs）、RNA、蛋白质、外泌体可以进一步对ctDNA中的分子信息进行补充。




图1：通过液体活检检测转移性肿瘤的异质性

然而，液体活检样本的分析是难度的，因为ctDNA是碎片化的，并且和生殖细胞cfDNA相比数量很少，从血液样本中只能分离获得为数有限的CTCs。因此，液体活检的肿瘤材料分析需要高度灵敏的检测方法，而这刚在过去的5年时间中实现。在此，我们简要概述几种可用作液体活检样本的源自肿瘤的成分。我们主要专注于ctDNA，因为这个在目前句有最广泛的临床用途。

基于血液的液体活检技术
血液中可以分离获得一系列肿瘤成分。而对这些成分的分子分析可以获得明确的和补充的信息（表1）。

表1：比较ctDNA、CTCs和外泌体的应用范围


CTCs：成分分析和实验模型
据推测，CTCs是全身循环或者被动的从原发性肿瘤和转移病灶进入血液循环系统的肿瘤细胞。1869年由澳大利亚内科医生Thomas Ashworth首次报道了CTCs的存在，但直到1990年末人们才意识到其临床价值。从癌症患者血液中可以分离获得CTCs的单个细胞或细胞群，CTCs数量可以与治疗结果和总生存期相联系。CTCs在血液中的丰度低（转移癌患者外周血中大约是1/10^9），但是也因肿瘤类型而异。

多项技术已被应用于CTCs分离，并已广泛应用于其他地方。简单地说，CTCs基于其大小、其他生物物理学特性，可以通过反向富集分离获得，或者通过使用表达在细胞表面的标记进行正向富集, 例如上皮细胞黏附分子（EpCAM）等。然而，虽然直接成像技术结合功能检测已被用于识别CTCs，我们仍然缺乏可以从非恶性上皮细胞中分离CTCs的标记。基于大小的选择方法发现了CTCs通常是大于正常血细胞的，但是这种方法可能导至CTCs的大量丢失，通过多种抗体混合物对这些细胞进行正向选择可以解决这一问题。此外，包括蛋白质、DNA和RNA等方法可以用来分析成分并帮助进行CTCs的鉴定。



外泌体
非肿瘤和肿瘤细胞能够释放多种微泡。细胞外囊泡（EVS）可分类为两组：第一种包括通过繁殖从细胞膜上脱落的微泡；第二种包含外泌体，是在多囊体（MVBs）和质膜融合的时候，通过胞吐作用分泌出来的。外泌体首次在1983年由Pan和Johnstone提出，是一种40-100 nm大小的由多种类型细胞释放到细胞外空间和各种体液中的细胞外囊泡。已知的血细胞、内皮细胞、免疫细胞、血小板及平滑肌细胞都释放外泌体。外泌体可以通过正常的密度梯度离心法从体液中提取。另外，外泌体可以通过超速离心分离，通过透射电镜观察，或基于特异性蛋白标志物的存在进行挑选，如四跨膜蛋白CD63、CD9和CD81。外泌体在细胞之间的分子信息交换中具有重要的作用：已证明外泌体含有蛋白质以及一系列的核酸，包括DNA、mRNAs和miRNAs，这表明它们可以调节受体细胞的活性。由于其所包含的成分，外泌体和其他细胞外囊泡可能被用来作为肿瘤标记物。

循环RNAs
1996年在黑色素瘤患者的血液中首次发现循环肿瘤相关mRNA，不久之后，在实体肿瘤患者的血循环中鉴定出了其他形式的RNAs，大部分是miRNAs与长链非编码RNAs（lncRNAs）。血液中来源于肿瘤的mRNA的存在是有临床意义的，包括肿瘤特异性基因表达谱的识别。DNA上的体细胞突变只代表与癌症相关的分子改变的一个子集，并不能完全概括基因表达谱的变化，其也可能是由于表观遗传学变化，miRNAs的影响或者其他机制造成的。因此，如果可行的话，基于血液的癌症RNA分析可以提供非常有价值的信息。

miRNAs是在血液中最丰富的cfDNA分子，并可以被外泌体、凋亡小体、蛋白-miRNA复合物和肿瘤血小板（TEP）所携带。血液中的miRNAs图谱似乎与实体肿瘤的起源有关。外泌体中miRNAs的数量和组成在癌症患者和非患者之间存在差异，这暗示了miRNAs可能是潜在的无创诊断的生物标志物。在cfRNA是否优先来源于肿瘤细胞，或者造血系统的细胞是否对提高cfRNA水平有很大的贡献（可能是由于免疫细胞对疾病的反应）的问题上，仍然是有争议的。大部分血液中mRNA和miRNA的分析仍然是属于探索性的，证实cfRNAs在临床上的价值还需要临床研究标准化科学报告的确认。cfRNA的临床意义目前还不清楚。然而，一个由NETest提供的关于临床效用的例子是，通过外周血中分离的mRNA的51个基因的目标表达谱，检测神经内分泌肿瘤的活性。

ctDNA：释放机制，特点，数量和质量

cfDNA的存在最初是在1948年由在癌症患者的血液中检测非细胞结合核酸的Mandel和Metais提出的。虽然炎症、自身免疫、吸烟、妊娠、运动和心脏功能障碍已被证明有助于cfDNA的出现，个体中ctDNA的起源和释放信息还是有限的。

1977年，Leon等报道说癌症患者的cfDNA量比没有这种疾病的个体要多。这一开创性的发现引发了进一步的研究：Stroun等发现，肿瘤患者的cfDNA中存在肿瘤相关的遗传性改变，和其他人的研究证实，在“ctDNA”中，即cfDNA中来源于肿瘤的部分，存在各种类型的肿瘤遗传性改变（即癌基因和/或抑癌基因的突变、微卫星不稳定性、表观遗传变异）。DNA被释放到血液中的确切机制仍不清楚。除了凋亡外，DNA片段可以通过其他机制被释放出来，包括坏死。事实上，肿瘤往往存在大量的坏死，这可能导至了体液中肿瘤DNA的释放。此外，巨噬细胞似乎通过吞噬坏死性肿瘤细胞，从而向循环中释放肿瘤DNA片段。对分离自孕妇血浆的cfDNA进行全基因组测序发现了一种碎片模式（~142 bp），让人联想到核小体核酸酶裂解，因为这表明cfDNA来源于细胞DNA的凋亡降解。有其他的研究对正常人和癌症患者的cfDNA长度分布进行了比较，发现了单个或多个核蛋白复合物的碎片大小的富集，这进一步表明细胞凋亡是cfDNA和ctDNA的主要来源。

一旦进入循环，cfDNA的清除是通过肾脏、肝脏、脾迅速发生的；孕妇的胎儿cfDNA的半衰期约为16分钟。目前还无法理解药物治疗、炎症和昼夜节律是如何帮助清除cfDNA的。对于ctDNA的分析，血浆要比血清样本好：血浆中cfDNA数量是血清的2-24倍，这可能是由于凝血过程中免疫细胞裂解释放了大量了DNA；因此，由于其野生型DNA背景水平较低，血浆已被证明是一个较好的ctDNA来源。


其他体液的液体活检

很多研究显示，来自肿瘤的核酸在其他体液中也存在，如尿液、唾液、脑脊液（图2）。在肺癌患者中，ctDNA也已在支气管灌洗液和胸腔积液检测到。事实上，肿瘤原发和转移病灶的位置对于对不同体液的ctDNA丰度的影响最大。

图2：体液是一种肿瘤分子信息来源

尿
20多年前，Zhang等报告说，在一个来源于男性的肾移植女性接受者中，可以在无细胞尿上清中检测到Y染色体SRY基因的DNA片段；然而，为什么肾脏过滤后还可以在尿液中检测到基因组DNA，直到10年后才证实，尿液中的cfDNA，也被称为肾脏DNA（tr-DNA），是由于肾脏对血中cfDNA清除的残留（图2）。因此在原则上，尿液可能是一个有用的肿瘤DNA来源，特别是考虑到尿液的收集比较简单并且无创，但事实上，我们对于癌症患者的tr-DNA特性了解的很少，这很令人惊奇。血浆的肾小球过滤是具有高度选择性的；只有直径<6.4 nm并且分子量小于70 kDa的分子复合物，等同于~ 100 bp的DNA，可以运输到肾单位管腔。个别患者的临床状况也可能会影响血液中的核酸进入尿液。例如，吸烟已被证明会影响尿液中的tr-DNA量。

虽然尿液中的肿瘤tr-DNA浓度在肾小球过滤后似乎并不能反映出血液中ctDNA的运输，但还是能够从泌尿生殖系统肿瘤患者尿液中的肿瘤来源核酸和配对的血液样本的相关性中获得有限的数据相反，泌尿生殖系统肿瘤患者中检测到大量的泌尿系肿瘤tr-DNA片段，这被认为是因为肿瘤细胞的脱落或是其分解产物直接进入尿路。

根据尿液中tr-DNA的大小，可将其分为两大类：高分子量DNA（≥1 kbp）和低分子量DNA（＜100 bp）。下一代测序（NGS）的方法已被用于评估孕妇尿液中tr-DNA片段的大小，揭示了大多数产妇和胎儿的tr-DNA片段构成少于100 bp，并在29 bp出现一个峰。和血液一样，DNase I是尿液中的主要DNA&#8209;水解酶，但尿液中该酶活性是血液中的100多倍，这可能解释了tr-DNA与cfDNA相比更加的碎片化。

由于高浓度的RNA水解酶，尿液中不存在mRNA；然而，miRNAs由于其体积较小（20-25个核苷酸），更耐核酸酶，可以在尿液检测到。此外，miRNAs比mRNAs更稳定，因此其经常存在于细胞外囊泡中，如外泌体，或结合于蛋白argonaute&#8209;2上。

目前，尿液中对肿瘤tr-DNA进行定量仍然存在困难，主要是由于其量太少了，即便是DNA扩增和测序技术的不断发展可能会促进这种方法。此外，我们应该注意到，尿液液体活检可以由患者在家中自己取样，并且可以替代活组织取样，真正地实现无创，因此和使用其他体液相比，尿液略胜一筹。tr-DNA液体活检和有可能实现术后对最小残余病灶（MRD）的检测。


脑脊液
脑脊液是由脑室脉络丛分泌。鉴于脑脊液是与中枢神经系统（CNS）的细胞直接接触的，包括那里的癌细胞，这种生物液体已被利用于构建脑瘤患者的“ctDNA”图谱（图2）。值得注意的是，尽管可以在大多数转移性癌症患者的血浆中检测到ctDNA，脑肿瘤患者，包括高级别的神经胶质瘤和髓母细胞瘤，可能是由于血脑屏障的存在，他们的血液中只有低水平的ctDNA。腰椎穿刺获取脑脊液是一种侵入性的过程，但这对于脑肿瘤（包括脑膜瘤、胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤）以及那些与软脑膜癌和淋巴癌患者来说，是很常规的方法。有证据表明，脑脊液也适用于肿瘤已经转移到脑部的患者的肿瘤来源DNA的分析。重要的是，De Mattos-Arruda等通过脑脊液中肿瘤来源的分析，发现了肿瘤类型（III或IV级胶质瘤、髓母细胞瘤，或室管膜瘤）和肿瘤位置（接近脑脊液储层或皮质表面）之间存在很强的关联性。不管怎样，考虑到脑脊液在整个脑室和脊髓中快速地循环，腰椎穿刺活检获得的脑脊液也可能被利用来进行ctDNA分析。


唾液
很少有对唾液中肿瘤来源DNA存在的检测研究（图2）。然而值得注意的是，Wang等分析了93例头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的唾液DNA，寻找潜在的肿瘤标志物。据推测，唾液中的肿瘤来源DNA可能从HNSCC细胞基底释放出来的。因此，使用多重PCR技术和大规模并行测序，对唾液和血浆样品中的人乳头瘤病毒（HPV）基因或头颈部鳞癌基因组区域的体细胞突变（如TP53、PIK3CA、CDKN2A、HRAS和NRAS）进行筛选，发现将血浆和唾液中的测试结果结合起来，不考虑肿瘤的部位，能够检测出96%的患者的ctDNA。虽然在口腔癌患者中可以100%检测到肿瘤DNA，但其他部位（咽、喉、orypopharynx）的癌症患者中只有47-70%能检测到，而这些病人组的血浆中ctDNA发现率分别是80%和100%。因此得出的结论是，唾液是对口腔来源肿瘤DNA的富集，血浆是对其他癌肿肿瘤DNA的富集，所以唾液是一个很有价值的口腔鳞癌检测生物标志物。


胸腔积液、支气管灌洗液
通过生理盐水溶液采集的胸腔积液和支气管冲灌液目前被用于呼吸系统癌症的诊断。在这里通过细胞学方法检测EGFR突变是可行的，当然也常常遇到困难，因为通常可用于分析的癌细胞数量比较有限。Kimura等评估一个替代的方法，通过非小细胞肺癌患者的胸腔积液检测EGFR基因18-21号外显子的激活情况。他们的研究结果表明，可以通过胸腔积液中的肿瘤cfDNA精确地检测EGFR的突变状态，并EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的反应结果相符。

在另一项研究中，检测了通过支气管灌洗液（也称为细胞学游离DNA，ccfDNA）鉴定肿瘤DNA的EGFR突变的可行性。结果表明，和肿瘤组织DNA相比，这种方法拥有更高的敏感性和特异性（分别为88%和100%），这说明可以通过ccfDNA准确地检测EGFR激活突变。因此，虽然还需要更多的研究对这种诊断方法进行验证，ccfDNA可能是一个替代细胞学样本的选择。


ctDNA分析技术
如上所述，循环cfDNA主要是由正常细胞的生殖系DNA和相当少的且数量容易变化的癌症患者ctDNA组成的。因此，传统DNA分析方法的灵敏度（如Sanger序）不足以检测癌症患者血浆ctDNA的体细胞突变。为了克服这些局限性，已经开发出了具有高分析灵敏度和特异性的数字PCR技术，具有高通量，在高峰度野生型等位基因背景下针对性地扩增检测感兴趣的突变基因，且检测限制达到0.0001%（这是ctDNA的强制性检测偏差）以下等能力（表2）。

此外，无固定范围的全基因组分析可以鉴定出原来未知的肿瘤特异性变化（表2）；因此，这种方法可以用于从头发现治疗抗性产生的基因变化，并鉴定出肿瘤患者的新激活靶点。高通量测序是一种通过将DNA片段固定在固体载体上，然后边合成DNA边读取序列的技术。使用高通量测序技术，可以在一个反应中获得数以百万计的ctDNA序列，并随后比对到参考基因组或来于自同一病人的生殖系DNA（即非恶性组织，通常外周血有核细胞）进行比较，它可以识别于参考序列相异的核苷酸变化（变异或突变）。已设计出多种高通量测序方法，不仅可以检测点突变和插入、缺失或重排，而且可以检测拷贝数变异和基因融合。

表2：ctDNA分析技术的比较


在未来，数字PCR和高通量测序可能会配合使用进行液体活检分析。前者可以动态分析个体产生的突变，但需要的已有的相关等位基因突变信息，而后者能够发现新的突变位点，但却具有较高的成本，不能很便利地应用于患者纵向监测。

结论
过去5年来，液体活检在肿瘤学中的应用以惊人的速度出现和发展。许多实体肿瘤患者进行的临床试验现在纳入了纵向血液收集，但是大多数的研究还只包含少量的患者。还需要进行更多的对照研究后，才能在临床实践中实施液体活检。目前，超过60个试验（预计超过20000例患者，涉及11种癌症类型）正在应对液体活检所带来的挑战。其中需要要解决的局限性包括：在室温条件下提高样本稳定性的血液采集标准化流程，从而减少分析前产生的偏差；明确ctDNA的量化方法；提高ctDNA分离产量的标准化方法；以及提高对ctDNA罕见突变的检测灵敏性，从而预测抗药性。

利用液体活检方法对于患者筛选可以提供更全面的肿瘤特征信息，包括其侵略性和整体分子图谱。在临床上的全面实施可能会包括：使用基于PCR的方法对部分候选基因进行初步分析，从而了解其突变热点，以此作为一个基准测试；然后确认是否有足够数量和质量的ctDNA存在；随之便是通过大范围的ctDNA测序揭示可行的治疗靶点。

总之，对于以血液为基础的基因图谱的临床应用构建而言，新一代的液体活检研究将起决定性作用。液体活检技术可能会提供更好的诊断能力，但一个关键问题是：由液体活检引导的治疗会获得更好的疗效吗？


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来源：上海细胞治疗研究中心原创整理