液态活检技术发展趋势

长长的路

基本介绍与发展现状

液态活检技术自问世以来便发展十分迅速，针对CTC、ctDNA和外泌体的分离、捕获、富集、纯化已经开发出诸如免疫法、磁分选法、膜过滤法、ddPCR法、差速离心法等，而关于其鉴定、分析也涌现了许多前沿技术，正是这些技术的不断涌现推动了液态活检一步步进入临床实践。虽然液态活检技术已经取得了长足进展，但科研工作者对于其持续的优化却一点也没有停止，从目前对液态活检技术研发的趋势来看，人们越来越倾向于研发自动化、微型化和高通量化的仪器，因为传统的手工操作方法存在步骤繁多、耗时长久、人为误差较大等问题，既不利于临床样本的大批量检测也难以确立稳定的富集效率和鉴别标准。所以，在现有技术的基础上充分地联合其他检测方法，在不增加整个检测过程的复杂程度的同时实现多模式的综合检测，以完成高效、准确、廉价的检测应是未来的开发研究重点。

目前关于CTC的检测已经出现了微流控技术、纳米技术和单细胞测序技术，这些技术的出现在一定程度上加速了CTC检测的自动化进程。尤其以微流控和纳米技术为代表，其精准的控制性能、高效的检测效率和简单便捷的操作优势已经助力其在生物医学领域大放光彩。目前很多自动化的检测平台均采用了该技术，下面分别介绍其各自的特性以及发展现状。

微流控技术

通常微流控指的是使用微管道处理微小流体的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。由于其具有微型化、集成化等特征，故微流控装置通常又被称为微流控芯片。微流控被认为在生物医学研究中具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景。目前的CTC芯片分选原理可以大概归纳为被动分选与主动分选两大类。不同种类的细胞在尺寸、密度、形状、可变形性及亲和性等物理、生物特性上各不相同，依据这些不同的特性，被动分选技术通过流道内的微结构或微流体对细胞施加作用，从而实现分离，一般具有通量高、不需要额外施加作用力场的优点。这些分离方法主要包括微结构过滤、场流及水力分选、确定性侧向偏移、惯性分选、仿生分选及亲和性分选等几类。主动分选技术通过外力场对样品流中的细胞施加作用力，从而致使其分离，其分选精度往往高于被动分选技术。这些分选方法主要包括介电泳分选、磁分选、声分选、光分选等几类。鉴于目前微流控技术还存在分选纯度不高、通量偏低等问题，尤其是面向外周血中含量极低的CTCs 的分选，难以同时满足高通量、高纯度的分选要求。因此，研究人员多采取将被动分选技术和主动分选技术相结合的多级分选芯片以达到对稀有细胞的分选要求。

被称为第二代CTC捕获技术的微流控CTC芯片技术（CTC-Chip）展示出了其用于分离检测CTC的极大潜力。CTC芯片是一张与标准载玻片尺寸相同的硅片作为固相支持物，上面排列了多个蚀刻特殊排列微单元。该方法非常灵活，可以与不同的CTC分选策略相结合，如各种不同的抗体都可以包被在固相支持物上，大大提高了敏感性和从全血中捕获稀少细胞的得率，同时操作过程相对简单温和，从而使分离到的CTC保持一定的活力。虽然目前的微流控CTC芯片在设计、加工工艺上更复杂些，但其良好的分选效果、轻巧的体积、较少的进样体积、较高的灵敏度和即用即弃的便捷特性正吸引越来越多的目光，是未来产业化发展的一个主要方向。

但是微流控芯片技术应用于稀有细胞分选仍然存在一定的不足，比如目前已经研究发现CTC存在16种亚型，为达到较高的捕获效率需要固定对应的抗体，而有些抗体尚未实现商品化或者CTC不表达相应的抗原就会造成漏检；现阶段微流控平台仍依赖于特异性的免疫识别，还无法做到对CTC全亚型和CTM以及被白细胞包裹的CTC的捕获，从外周血液中获取极少的CTC仍存在较大的困难，并且需要耗费一定的时长以保障其能发生较为充分的免疫反应，即便是基于抗原抗体吸附的方法仍不能完全避免CTC丢失的情况；而且微通道中微结构的挤压，高剪切流的流场，外加的电场都会对细胞的活性造成一定程度的损伤，对后续的分离培养造成困扰。

纳米技术

近年来纳米技术的飞速发展，已被成功应用到许多领域，包括医学、药学、化学等。纳米颗粒具有独特的光学、电学、化学、机械和物理性质，这在解决医学检测方面的难题上起到了巨大的促进作用。纳米材料根据材质和形状不同可分为很多种，如金纳米颗粒、磁纳米颗粒、碳纳米管、纳米孔和微悬臂等。随着纳米技术的发展，人们可获得结构可控、表面功能化的不同种纳米材料，纳米材料所表现出的小尺寸效应、高比表面积等诸多不同于一般材料的特性，使血液中极少量的CTC 的捕获成为可能。纳米材料与纳米结构与CTC的高接触几率，也可以大大提高CTC的富集效率被广泛用于CTC的富集和检测。纳奥生物基于第三代非抗体依赖的捕获技术开发的Nextctc循环肿瘤活细胞捕获仪即是结合了国际领先的纳米技术和微流控技术，率先在国内实现了非抗体依赖的CTC活性单细胞无损捕获，利用纳米技术捕获分离的CTC细胞保存了原始的活力，完全可以用于后续的药敏试验和全基因型测序，而且还可以最大限度地捕获上皮来源、间质来源以及干细胞来源所有表型循环肿瘤细胞，最大程度地降低了因为发生EMT过程或形成CTM以及被其他细胞包裹所造成的漏检。鉴于纳米材料的诸多优点，将纳米颗粒应用到CTC的检测中具有非常巨大的潜力。

单细胞测序技术

单细胞全基因测序技术及单细胞基因组学的发展，某种程度上解决血液CTCs数量稀少的难题，不需要获得大量的CTC即可进行基因组学的分析，能检测更多药效相关基因及分析耐药机制，为CTCs的分子分型及靶向药物治疗提供更准确的信息。基因或基因组变异是肿瘤发生的根本原因，利用单细胞全基因组测序技术，可以更精准地获取肿瘤细胞并深入分析，发现正常细胞与肿瘤细胞差异，了解癌细胞的基因突变，鉴别肿瘤的来源、分析肿瘤生长规律，为早期诊断肿瘤和开展肿瘤个体化治疗提供指导。此外，肿瘤的异质性是导至肿瘤耐药的原因之一。从单个肿瘤细胞水平对肿瘤单细胞进行测序，找出一个肿瘤在单个细胞上的共同结构，揭露每个肿瘤细胞的突变规律，为抗癌药物研究、肿瘤靶向治疗提供基础。

总结与展望

目前，尚存在循环肿瘤细胞数量稀少，与正常细胞的整体差异不是很明显，且不同部位的肿瘤及不同病人的同部位肿瘤的性质也可能有所不同；早期癌症患者体内的ctDNA难以富集足够浓度，早期难以检测发现；外泌体虽然性能稳定，但目前研究还不充分等问题，这都增加了检测的难度，也是未来需要解决的问题。但是随着检测手段的不断进步，检测灵敏度和稳定性的逐步提高，技术瓶颈终会被突破，在可期的将来随着技术的成熟，液态活检各种方法联合使用将在肿瘤早期筛查、动态监测、预后判断以及产前诊断等领域发挥越来越重要的作用，因为单一的检测方法已经不能满足临床的需要，而越来越倾向于CTC、ctDNA和外泌体联合辅助诊断，只有液态活检的“三驾马车”携手并进才能更好地推动液态活检真正走入临床治疗实践，成为辅助诊断密不可分的一部分。

来源: 转化医学网  作者： 杨昂