PCR，Microarray，NGS哪家强？

检验之星

基因变异、靶向药物和分子诊断
视力不好，看不清东西就需要戴眼镜。大千世界无奇不有，有时候也需要借助一些“眼镜”来帮忙。陈斯卡的个人经验，经济学和进化论是两副非常管用的眼镜。戴上这两副眼镜未必能解决问题，但至少能帮助看清问题、理解问题。

进化论的主题之一是变异，经济学的主题之一是竞争。基因的变异是导至疾病的原因之一，例如肿瘤。现在有些肿瘤的治疗已经进入精准治疗的时代，例如肺癌。在这样的大背景下，进化论层面的变异直接导至了经济学领域的竞争。各大医药公司针对不同的肿瘤驱动基因已经开发了和正在开发不同的靶向药物，大家从下面这张表就可以感受到竞争的激烈。这种竞争的局面，表面是药厂根据驱动基因的不同突变类型为患者“定做”不同的药物，本质就是药厂已经进入了根据基因变异来竞争患者的阶段！



那么问题来了。既然靶向药物是根据不同的“靶”来开发的，那么在用药前自然需要掌握患者体内这些“靶”的情况，怎么知道这些“靶”的定性和定量信息呢？分子诊断可以提供这类答案，各类分子检测方法在疾病的不同阶段能完成不同的任务(具体见下表)，核心目的是提供能够帮助医疗决策的信息。提供的信息越具有明确的clinical utility，分子诊断方法就越能被临床所接受。



目前，分子诊断的方法大体上可归纳为三类：PCR、NGS和杂交类方法。每类方法又存在诸多变体，并且各类方法在具体操作流程上也互有渗透，国际市场上主要的厂家及各自对应的方法见下图。对于在临床上的应用，美国FDA对IVDs的核心考核指标见下表。

以肿瘤的组织检测和血液检测为例，基于上述三大类方法的各种分子诊断主要用于各种临床样品中体细胞突变的检测，其中如何提高突变位点检测的准确度和灵敏度是各种方法面临的核心难点。难点的根源是：如何在大量野生型序列的背景中识别出具有临床价值的突变位点？换句话说：各种IVDs如何克服大量野生型序列对少量或极少量突变序列在分子层面的竞争？更要命的是：很多情况下这种竞争只存在一个核苷酸的差别。所以问题又绕回来了：一开始各药厂根据基因突变展开药物研发和生产的竞争，接着各诊断公司又在不同方法学的基础上各显神通，研发各种检测方案克服分子之间的竞争，把那些具有clinical utility的突变位点给找出来。



1ARMS(amplification-refractory mutation system)方法，设计原理见下图a和b部分。Roche、Qiagen和厦门艾德基于ARMS方法针对不同肿瘤、不同突变位点开发了多种检测试剂盒，并分别获得FDA、CFDA和CE-IVD认证。ARMS技术本身还存在多种变体，如在体系中引入针对野生型序列的blocker和双扩增引物，前者如ThermoFisher的castPCR，后者如Seegene的DPO技术，设计原理见下图c和d部分。总体上，ARMS是通过引物来克服野生型序列和突变序列的竞争。


2Blocker PCR。Blocker PCR在扩增过程中采用的引物是通用的，与ARMS不同，Blocker PCR引入了针对野生型序列的Blocker来克服野生型序列和突变序列的竞争。其中的Blocker有PNA、XNA和IDT公司的rhPCR(RNAse H依赖的PCR)，不同公司的设计原理见下图。


3数字PCR。与上面介绍的ARMS和Blocker PCR不同，数字PCR检测体系绝大多数还是采用经典的TaqMan双探针设计思路。数字PCR通过partition的方式来克服野生型序列和突变序列的竞争。实现partition的方式主要有液滴式和芯片式两种，液滴式数字PCR的原理见下图。




杂交01
杂交是依靠碱基配对来实现核酸检测的一类基础方法，杂交类方法经常和PCR扩增技术结合使用。和PCR相比，杂交最大的特点可以实现多重检测。Microarray大致的原理及操作流程见下图所示。目前市场上多个公司的产品获得FDA的批准，如Agendia公司的MammaPrint和Autogenomics公司的INFNITI CYP2C19等等。由于技术本身的限制，Microarray在核酸片段的定量方面存在短板，不同的设备甚至是不同批次芯片之间的结果存在偏差。



02
液相杂交。以Luminex和Nanostring为代表的两家公司采用了荧光barcode标记技术，相比于固相芯片，在保持了杂交类方法多重检测特点的同时，对核酸的检测实现了均相的方式。Luminex和Nanostring的荧光barcode大致原理见下图。




NGS1以Illumina和ThermoFisher为代表的NGS技术综合了PCR和杂交类方法的优点，既能实现多重的检测，又兼具了PCR方法在定量和检测灵敏度方面的优势。2测序前的靶序列富集。NGS虽然拥有强大的测序能力，但是如何克服野生型序列对待测突变序列的竞争呢？这就需要在测序前对序列进行富集，对应两大主流的测序平台，序列富集也主要采用两种方式：Illumina采用杂交/捕获的方式，Ion Torrent采用多重PCR的预扩增方式(Ampliseq)。Illumina杂交/捕获方式的工作流程大致如下图所示。



3基于液滴技术的序列富集。多重PCR的预扩增与数字PCR核心的液滴生成技术相结合，产生了基于液滴的序列富集方式。这种NGS前的序列富集方式以RainDance公司为代表。Ampliseq和RainDance公司的技术流程见下图。




陈斯卡观点，一孔之见1“PCR、Microarray和NGS哪家强”是个伪问题。原因有二：第一，如本文的封面图片所示，这三种方法本身就互为渗透、互为依赖；第二，陈斯卡坚持认为脱离了具体应用的技术比较是浪费时间。2目前来看，NGS如火如荼。但是对照本文开头第二个表格，目前NGS提供的基因组或转录组层面的信息是否对患者有意义？更何况评估分子诊断的还需要综合其他诸多因素：设备和检测的成本、检测周期、对操作人员的要求、实验室的标准化等等。打个比方，飞机确实是目前最快的交通工具。但考虑到目前民航的准点率水平，有时候高铁是更加靠谱的选项。3最值得人们担心的竞争来自“看不见”的对手。诺基亚CEO在记者招待会上公布同意微软收购时，最后说的一句话意味深长：“我们并没有做错什么，但不知为什么，我们输了。”因为诺基亚没有看见“看不见”的竞争对手。测序领域，除了Illumina和ThermoFisher之外，还有Pacific Biosciences、Oxford Nanopore。PCR领域，虽然设备还没有获得FDA的批准，Trovagene基于数字PCR已经开发了尿液样品的BRAF V600E检测；在国内，针对血液检测的各种升级版ARMS技术呼之欲出；此外，还有近年来呼声渐涨的等温扩增技术和超速扩增技术。

文中图片出处：Advanced Drug Delivery Reviews. 2016 Oct 1;105(Pt A):3-19. Diagnostics based on nucleic acid sequence variant profiling: PCR, hybridization, and NGS approaches. Khodakov D, Wang C, Zhang DY.

来源：数字PCR的可能性  作者： 陈寅清