Nature高分子刊！通过Cas13a反应动力学差异进行多重检测的新技术

01

作者构建了一个基于乳化液滴的Cas13a直接检测体系。把含有Cas13a、crRNA、荧光报告分子和靶RNA的反应液打成皮升级别的小液滴，每个液滴中大约只有一个靶RNA分子。液滴内信号是单个靶标激活Cas13a反应的动力学轨迹，而不是平均信号。结果显示，Cas13a信号累积速度随着液滴变小而明显加快，同样是一个靶RNA分子，放在常规PCR管、100 μm液滴和30 μm液滴中，等效“活性酶浓度”以及信号斜率呈数量级提升（图a-d）。

02

作者设计了多个针对SARS-CoV-2 N基因不同区域的crRNA，并比较了crRNA 4、crRNA 11和crRNA 12的反应速率。结果显示，crRNA 11 和 crRNA 12在大体积反应中的反应速率明显低于 crRNA4（图a）。不仅如此，通过检查信号时间轨迹，作者发现这三种 crRNA 和靶序列导至了不同的动力学行为，单个轨迹的斜率、形状和 x 轴截距差异都很大（图b–e），这说明，不同crRNA的差异不只是终点信号强弱不同，而是体现在斜率、轨迹平滑程度、起始延迟时间等多个层面。

作者进一步量化了这些差异。结果表明，Cas13a单分子层面的反应模式显著依赖于具体的crRNA/靶RNA配对关系。局部或整体RNA结构可能参与塑造Cas13a的动力学表现，crRNA动力学上的不同本身是一种可以被利用的信息。

03

在发现不同crRNA/靶RNA组合具有可区分的动力学特征后，作者提出了 kinetic barcoding的概念。可以在同一套反应体系里同时加入多个有反应速率差异的crRNA，通过分析阳性液滴的轨迹特征来判断样本中究竟是哪一种病毒（图f）。

作者先以HCoV-NL63和SARS-CoV-2为例进行了验证（图g）。结果显示，这两类靶标所对应液滴的斜率和RMSD分布能够形成可分离的群体，借助支持向量机分类，单个液滴轨迹可实现约75%的个体区分准确率。多个阳性液滴的信息整合后，识别能力显著增强。分析表明，如果测量了 20 个或更多的阳性轨迹，那么动力学条形码技术能够在 10 分钟内区分 HCoV-NL-63 和 SARS-CoV-2 的靶标（图j）。

04

仅依赖天然crRNA的动力学差异不可行，作者发现在crRNA的5'端添加一段单链DNA序列，形成一种杂交引导分子igRNA，会降低报告分子切割速率。DNA越长，且其中胸腺嘧啶（T）越多，Cas13a反应速率下降越明显（图b）。通过在crRNA上加不同长度、不同序列的DNA尾巴，能够在单分子层面上精确调控 Cas13a 的反应速率。

05

作者选取了4个不同病毒相关靶标，SARS-CoV-2野生型、SARS-CoV-2 delta、HCoV-NL63以及甲型流感H3N2。经过DNA修饰的crRNA使各个靶标在液滴中的斜率分布有显著差异，并且在把所有crRNA混入同一反应后，这些斜率特征仍能基本保持稳定，从而实现多重识别（图a）。

作者进一步研究了这种策略在SARS-CoV-2变异株检测中的应用。作者设计了一个三crRNA组合，一个针对SARS-CoV-2保守区，另两个分别针对delta和omicron特异突变，并对其加入不同DNA修饰。结果显示，野生型RNA会形成单峰分布，而delta或omicron既能被保守位点识别，又能被相应突变位点识别，会形成特征性的双峰分布，从而区别开来（图c）。 

在中高病毒载量样本（Ct < 20）中，作者测试了15份SARS-CoV-2阳性样本，并对其变异株类型进行了鉴定，结果显示使用动力学条码技术，这些样本均可被正确分类（图e）。