在分析检测领域，方法的“灵敏度”是评价其性能的核心指标之一，直接决定了该方法能否有效服务于科学研究、质量控制和法规监管。然而，对于如何科学、严谨地确认一个方法的灵敏度，实践中常存在概念混淆、指标误用和操作不规范等问题。本文将系统阐述灵敏度的科学定义与法规依据，辨析不同应用场景下的确认指标，并详细说明实验设计流程，以期为分析方法开发、验证与应用提供清晰的实践指南。 1. 科学定义的双重内涵 分析化学中的“灵敏度”具有狭义与广义之分。 狭义灵敏度，即理论灵敏度 特指校准曲线的斜率。它量化了仪器响应值（信号）随分析物浓度变化的速率，其数学表达式为线性方程 中的斜率 。斜率越大，表明单位浓度变化引起的信号变化越显著，方法的理论响应能力越强。 广义灵敏度，即实践灵敏度 指方法可靠检测或测定低浓度分析物的整体能力。在日常工作和绝大多数标准语境下，“方法的灵敏度”指的就是这种低浓度检测能力。此时，它并非单一数值，而是一个由多个具体指标刻画的综合性能。 2. 国内外法规与标准要求 国内外权威机构发布的技术指南与标准，均将方法灵敏度（尤其是其实践内涵）的确认列为方法验证或确认的强制性要求。 ICH Q2(R1)：人用药品注册技术要求国际协调会发布的《分析方法验证：正文与方法》，是药品领域全球公认的权威指南。它明确要求验证项目的清单中包含“检测限”和“定量限”，并给出了基于信噪比、标准偏差与斜率等具体测定方法。 美国FDA指南：在其多个行业指南（如《生物分析方法验证》）中，明确规定必须确定方法的LLOQ（最低定量限）和可能情况下的LOD（检出限），并对LLOQ处的准确度与精密度提出了明确的可接受标准（通常为±20%）。 美国EPA：在环境检测领域，EPA方法要求中严格规定了“方法检出限”的测定程序（如EPA 40 CFR Part 136附录B），要求基于重复测定空白加标样品进行计算，确保结果的统计可靠性。 CLSI EP17-A2：美国临床和实验室标准协会的《检出能力和定量能力的评价方案》文件，为临床检测领域提供了最详尽的空白限、检出限和定量限的评估框架，强调基于大量空白和低浓度样本数据的统计模型。 《中国药典》通则9101：“药品质量标准分析方法验证指导原则”中，将“检测限”与“定量限”列为关键的验证项目，其定义与测定方法与ICH指南高度一致。 GB/T 27417-2017：《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》国家标准，系统规定了方法验证的各项参数，明确指出“检出限和定量限是评估方法灵敏度的重要参数”，并推荐了相应的实验与计算方法。 这些法规与标准的共同核心在于：要求实验室提供客观、可重现的实验数据，以统计学的、可辩护的方式确认方法的检测能力下限，并确保此能力满足既定用途（如法规限量）的要求。 “灵敏度”的确认指标并非一成不变，其选择必须紧密围绕检测目的。应用场景决定了“可靠”二字的具體含义，进而决定了应以何种指标作为确认的核心。
确认LOD和LOQ需要遵循结构化、统计严谨的实验方案。以下介绍两种主流且被国际标准广泛采纳的方法。 方案一 基于空白与低浓度样品标准偏差的统计方法（推荐） 此方法逻辑严谨，符合CLSI EP17等指南精神，结果具有强统计辩护性。 1. 前期准备与接受标准设定 定义：明确采用何种计算公式（如，基于空白标准偏差法）。 接受标准：预先设定LOQ的接受标准，例如，在该浓度下，重复测定的相对标准偏差≤15%，且平均回收率在85%-115%之间。 基质：使用有代表性的空白基质（如空白血清、空白土壤提取液）进行所有实验，以确认方法检出限。 2. 实验材料与数据采集 空白样本组：独立制备至少 10-20份 空白基质样本。 低浓度加标样本组：在空白基质中，添加分析物至一个接近预期LOD的浓度（如1-3倍预期值）。独立制备至少 10-20份 该浓度样本。 分析测定：在尽可能短的时间内（保证系统稳定性），以随机顺序对所有样本进行测定，记录响应值（峰面积、吸光度等）。 3. 数据处理与计算 计算空白限：计算空白组响应值的均值（μb）和标准偏差（sb）。 空白限 = μb+1.645sb（单侧95%置信水平，假设正态分布） 计算检出限： 计算低浓度加标组响应值的标准偏差（ss）。 检出限 = 空白限 + 1.645ss。对于通常的应用，一个被广泛接受的简化公式是：LOD = 3.3×sb （当低浓度样品SD可用空白SD近似，且通过校准曲线斜率换算成浓度时，公式为：LOD = 3.3×sb/斜率） 确定与验证定量限： 准备一系列低浓度加标样本（例如，预计LOQ的0.5倍、1倍、2倍和5倍）。 对每个浓度水平进行至少 6次 重复测定。 LOQ是能够同时满足以下两个条件的最低浓度： 1. 精密度：6次重复测定的RSD ≤ 预设标准（如15%）。 2. 准确度：平均测定浓度与理论浓度的比值（回收率）在预设范围（如85%-115%）内。 常用经验公式 LOQ = 10×sb/斜率 可作为实验起点的参考。 方案二 基于信噪比的方法（适用于色谱、光谱等仪器方法） 此方法直观，在仪器分析中应用广泛。 1. 实验设计 配制一个信噪比适中的低浓度标准溶液（或基质匹配标准溶液）。 对该溶液进行连续至少 6次 重复进样。 2. 数据处理与确认 计算平均信噪比：测量目标分析物峰附近的基线噪声（通常取峰-峰噪声或一定时间窗口内的RMS噪声），计算每次进样的信噪比（S/N），然后取平均值。 确认检出限：普遍接受的标准是，当 S/N ≥ 3 时，对应的浓度可被确认为LOD。 这意味着信号有99.7%的置信度不同于噪声。 确认定量限：普遍接受的标准是，当 S/N ≥ 10 时，对应的浓度可被确认为LOQ。 必须补充验证：在该浓度水平下，进行至少6次独立实验，其精密度（RSD）和准确度（回收率）需达到预设标准。仅有S/N≥10是不够的。 通用验证与报告要求 无论采用何种方案，最终都必须： 1. 独立验证：用最终确定的LOD和LOQ浓度，配制新的、独立的验证样本进行测试。对于LOD浓度，其检出率应显著高于误报率；对于LOQ浓度，其性能应再次符合预设的精密度与准确度标准。 2. 完整报告：在方法验证报告中，必须清晰、完整地记录： 灵敏度确认所依据的标准或指南。 使用的具体方法（如“基于空白标准偏差法”）及详细计算公式。 所有原始数据（空白响应值、低浓度样品测定值）。 计算得出的 LOD和LOQ的数值、单位。 LOQ处的关键性能数据：重复测定次数（n）、平均值、标准偏差、RSD%、回收率%。 实验所用基质的说明。 确认方法的“灵敏度”是一个严肃的、系统性的科学实践，而非简单的经验估计。它要求分析人员： 首先，深刻理解检测目的，从而选择正确的核心确认指标——定性筛查看LOD，定量决策看LOQ。 其次，遵循权威的技术规范，设计具有足够统计效力的实验，获取空白与低浓度区域的可靠数据。 最后，以完整、透明的方式报告结果，特别是LOQ必须附带其精密度与准确度的“性能担保”。 |
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