实验教程｜浙大学姐手把手教你做CRISPR/Cas9

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RNA如何整合到载体DNA中？ CRISPR/Cas9的基因编辑是如何实现的？如何确定目标序列的剪切起始位点？在此过程中，需要设置对照实验。我们使用的是ABCLON的GOLDEN GATE混合液，可一步完成酶切和连接反应。那么，CRISPR/Cas9与载体构建有何区别？
今天我们将探讨CRISPR/Cas9的相关知识。CRISPR/Cas9源自细菌的免疫系统。在自然界中，细菌会遭受病毒（即噬菌体）的攻击。当噬菌体入侵时，细菌会截取一段病毒DNA插入自身基因组的CRISPR区域，称为spacer。当相同病毒再次入侵时，细菌就能识别这段spacer对应的病毒DNA，并利用CRISPR系统中的Cas9蛋白切割病毒DNA，实现免疫防御。
在细菌中，Cas9是位于CRISPR位点附近、负责编码DNA切割蛋白的基因。科学家将CRISPR与Cas9结合，构建到载体中，开发出能够定点修饰DNA序列的分子生物学工具。无论是基因敲除、报告基因插入，还是点突变，CRISPR/Cas9都能胜任。
实验中，我们使用由Cas9蛋白和sgRNA组成的”分子剪刀”。sgRNA（Single Guide RNA）是一种合成RNA，包含两个部分：crRNA负责引导Cas9识别目标DNA序列，tracrRNA则协助crRNA与Cas9结合。现代实验中通常使用融合的单链sgRNA替代。
可能有同学会问：最终需要构建的是DNA载体，RNA如何整合到DNA载体中？实际上，我们设计的是编码sgRNA的DNA序列（sgDNA），将其插入表达载体，使其在细胞内转录生成sgRNA。
sgRNA如何引导Cas9定位目标DNA？其crRNA部分通过人工设计，与目标DNA序列完全互补；tracrRNA部分则具有固定结构，用于稳定sgRNA与Cas9的结合。正是crRNA与目标序列的碱基配对，确保了CRISPR/Cas9的精确定位。
接下来，我们将探讨CRISPR/Cas9在体外实验中的应用原理。
首先，构建含有sgRNA和Cas9的载体序列，并将其导入细胞中进行表达。sgRNA会引导Cas9定位到目标DNA序列，随后Cas9在目标位点进行切割。当细胞修复DNA时，可能出现错误，即非同源末端连接，或通过人为编辑实现同源重组，从而完成DNA编辑。这一过程与之前提到的载体构建步骤相似。
CRISPR/Cas9技术的核心在于载体酶切与连接部分。实验中使用了AppColon的Golden Gate 2X Assembly Max预混液，可一步完成酶切和连接反应，实现多达8个插入片段的特定顺序组装。相较于传统方法需要4-5小时，现在仅需半小时即可完成所有步骤。经测试，试剂反复冻融20次或在37℃存放7天后性能保持稳定。
接下来详细解析CRISPR/Cas9在体外实验中的作用机制。首先，已表达的sgRNA会与Cas9蛋白结合形成复合体。该复合体在基因组中扫描时，Cas9并非随机结合DNA，而是需要识别PAM序列。PAM是Cas9识别并启动剪接的信号序列，通常为NGG（N代表任意碱基）。若无PAM序列，Cas9既不会停留也不会剪切。这一特性源于CRISPR/Cas9系统的进化起源：作为细菌的防御系统，Cas9通过识别病毒DNA特有的PAM序列来区分外源DNA与宿主DNA。
当定位到目标DNA后，Cas9会使DNA局部解旋。sgRNA的前20个碱基将与DNA单链进行配对验证。完全匹配后，Cas9会在PAM序列上游约3个碱基处产生双链断裂（DSB），实现基因编辑。
接下来我们将进行DNA改造。请注意，在整个载体构建过程中，我只提到了用于识别目标基因序列的sgRNA，而并未像常规载体构建那样指定插入的具体目标序列。那么CRISPR/Cas9系统是如何实现基因改造的呢？
首先需要明确，Cas9蛋白本身并不改变DNA序列，它仅起到”分子剪刀”的作用。DNA切割后，基因编辑的完成依赖于细胞自身的修复机制。当Cas9完成切割后，会产生双链断裂（DSB）。细胞修复双链断裂主要有两种途径：

• 非同源末端连接（NHEJ）：这是细胞的默认修复方式。该机制直接将断裂的DNA末端连接起来，不依赖任何模板。这一过程常会导致几个碱基的插入或缺失，造成阅读框移位或蛋白质失活，从而实现基因沉默的效果。
  
• 同源重组修复（HDR）：当提供包含报告基因或特定突变的修复模板时，细胞可利用该模板进行精确修复。这种方法适用于需要插入报告基因或引入特定点突变的情况。
  

本期内容以基因敲除（沉默）为主。虽然同源重组在载体构建中也经常使用，但由于其涉及的内容较为复杂，在此不做详细展开。如有需要，后续可专门讲解同源重组相关内容。
CRISPR/Cas9系统与传统载体构建的主要区别在于：传统方法（如基因过表达或敲低）通常不改变DNA序列本身，而是调控其表达；而CRISPR/Cas9直接对DNA进行切割和修改，效果更为精准彻底。
实验所需材料包括： - 含有Cas9的载体 - 表达sgRNA的序列 - 细胞系或生物模型（如293T细胞、小鼠胚胎干细胞等） - 若需插入报告基因，还需准备修复模板
关于CRISPR/Cas9载体，市面上有多种类型可供选择，具体信息请参考相关资料。
我这里使用的是lentiCRISPRv2载体，它属于慢病毒感染系统，一次感染即可完成基因编辑。配套的sgRNA为BR3-B1，我使用的是Abclone公司提供的BR3-B1预混液。
首先，我们需要了解实验的整体框架和具体操作步骤。


这里需要说明的是，接下来介绍的所有实验步骤均适用于基因沉默，即基因敲除。


若需报告基因相关内容，我们将另行制作视频讲解。
首先，设计并合成sgRNA序列。此前已提及，sgRNA的tracrRNA部分固定不变，仅需设计其crRNA部分。在此过程中，可选用在线sgRNA设计工具完成操作。常用工具已列出，可根据个人偏好进行选择。
关于目标序列的剪切位点选择，建议选取起始密码子后第一个或第二个外显子区域，优先选择保守外显子，以确保对所有剪切体均有效，同时需避开功能未知的可变剪切区域。
sgRNA序列的筛选标准可参考以下要点。


确定好sgRNA序列，还记得我们之前提到的内容吗？


我们克隆的是与sgRNA序列对应的sgDNA序列，因此实际合成的是sgDNA。直接将设计工具生成的序列送至合成公司即可，无需额外添加酶切位点和tracrRNA部分。
本实验采用的LentiCRISPR v2载体已包含tracrRNA序列，故无需另行合成。使用时需确认所用载体是否包含tracrRNA序列。我们只需在合成的sgDNA序列上添加酶切位点，最终送公司合成的DNA序列即告完成。
第二步是构建CRISPR载体，以LentiCRISPR v2为例。首先酶切CRISPR载体并与sgDNA序列连接。可能有同学会问：为何省略PCR步骤？这是因为sgDNA序列已由公司直接合成，无需扩增。此前进行PCR是因插入载体的目标序列过长，需先合成引物再扩增。如有疑问可回顾相关视频内容。
关于酶切验证，本实验无需设置对照组。因仅使用一种酶，酶切后即可直接连接。我们采用Agilent的GelGreen预混液，可实现酶切与连接同步进行，故无需验证酶切效率，只需最终筛选测序正确的质粒。
推荐载体与sgDNA用量及反应体系如下：按比例配制后，42℃水浴反应10分钟即可。相比传统方法耗时两日，此方案仅需半小时即可完成。Agilent新推出的GelGreen预混液确实高效便捷。
第三步包括转化筛选、测序、质粒提取、慢病毒包装及感染等步骤，具体操作可参考相关视频教程。
第四步是筛选CRISPR阳性细胞。常用方法为抗性筛选：LentiCRISPR v2载体携带两种抗性基因，分别为氨苄青霉素抗性和氨甲蝶呤抗性。
那么我们具体采用哪种方法呢？氨苄青霉素筛选用于筛选带有正确质粒的大肠杆菌，而抗性筛选则用于筛选阳性细胞。
第二种方法是单克隆筛选，即将CRISPR/Cas9感染后的细胞群分离成单个细胞克隆，再逐一进行测序检测，以确认是否完成了基因编辑。这显然是一项工作量巨大的任务。
若仅需获得稳定敲除的细胞群，则无需进行单克隆筛选，仅需进行抗性筛选即可。所谓稳定敲除的细胞群，是指通过qPCR、Western blot等分子检测手段对比阳性与阴性细胞群时，可观察到阳性细胞群表现出明显的敲除效果。但这并不意味着阳性细胞群中的每个细胞都经过了CRISPR/Cas9编辑，仅表明其整体表现出了编辑效果。
若需要获得纯合敲除的细胞系，则必须进行单克隆筛选，例如用于长期稳定实验时，需确保编辑的一致性。此外，敲入实验或点突变实验通常也需要进行单克隆筛选。
抗性筛选操作较为简单，可参考文字版实验方案。我们将重点讨论单克隆筛选的两种方法：有限稀释法和流式细胞分选法。


稀释法操作步骤如下：
首先，对感染后的细胞群进行抗性筛选，随后将细胞消化为单细胞悬液，并使用细胞计数仪进行计数。根据细胞密度，计算稀释目标浓度，即每孔平均0.5-1个细胞。
对于90孔板体系，每孔加入100微升细胞悬液即可。因此，细胞悬液需稀释至500-1000个细胞/毫升。根据稀释公式计算稀释倍数，使用完全培养基稀释细胞并充分混匀。
此外，建议设置不同稀释梯度（如0.5个细胞/孔、1个细胞/孔、2个细胞/孔），以确保获得单细胞克隆。


取出96孔板，每孔加入100微升稀释后的细胞悬液。


轻轻晃动96孔板使细胞分布均匀，放入37摄氏度培养箱中孵育。
第1至3天，每天用显微镜检查并标记含有单克隆细胞的孔，可在盖板上标记或用Excel表格记录。舍弃含多细胞或无细胞的孔，每2至3天更换一次培养液，维持10至14天。
当克隆生长至70%至90%融合时，可转至24孔板扩大培养，再扩增至6孔板等。
获得足够细胞后，先冻存一批，请务必养成及时冻存细胞的好习惯。


欢迎各位，若在实验过程中遇到问题，可以追溯问题所在。
接下来进行测序验证，以确认单克隆细胞是否为所需的阳性细胞。
第一步，设计引物，扩增目标区域，覆盖切割位点上下游约200至400个碱基对。引物设计的具体内容请参考相关笔记，关键点已在此处标注。
第二步，使用细胞基因组DNA提取试剂盒提取DNA。不同试剂盒的操作方法各异，此处不再演示。最终DNA浓度应达到50至200纳克每微升，OD260/280比值约为1.8。
第三步，进行PCR扩增。详细步骤已在笔记中说明，未了解的实验人员可查阅相关内容。
第四步，将样本送至测序公司进行测序。如何评估测序结果？可查看公司提供的测序图谱，或使用分析工具进行判断。
若在此阶段顺利获得纯合的阳性细胞，则实验成功。


因为单克隆筛选通常是一个耗时较长的过程。
除了单克隆筛选，还有流式分选。由于流式分选之前已详细讲解过，此处不再演示。
具体的CRISPR/Cas9实验流程已为大家整理在此。


如果尚未了解刘氏相关内容，可以参考以下笔记。
CRISPR/Cas9技术涉及的内容非常广泛且复杂。在此，我将重点介绍实验室中常用的部分内容。如需了解更多详细信息，欢迎留言咨询。


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