凋亡实验全流程攻略

生物科研实验室

一、样本制备方面

      1. 贴壁细胞消化 对于贴壁细胞，优先推荐采用不含EDTA的胰酶进行消化处理。这是因为EDTA可能会干扰细胞膜的结构和功能，进而影响后续Annexin V对磷脂酰丝氨酸外翻的检测。若实验条件限制，不得不使用含EDTA的胰酶，那么在终止消化后，必须对细胞进行充分洗涤。通过多次离心、更换无EDTA的培养基等操作，尽可能彻底地去除残留的EDTA，以降低其对实验结果的潜在干扰，确保细胞膜的完整性得以最大程度地保留，从而为后续的凋亡检测提供准确的细胞膜状态基础。 2. 难消化样本处理 面对一些较难消化的细胞或组织样本，如某些肿瘤组织细胞、特定的干细胞类型等，建议采用分批次消化的策略。具体操作时，可将样本分成若干小块，依次加入适量的消化酶溶液，每隔一定时间轻轻摇晃或轻柔吹打，观察消化进程。这样做的目的是避免一次性加入大量消化酶导至先消化下来的细胞因过度消化而受损，进而产生假阳性结果。过度消化会使细胞膜完整性被破坏，使得原本未发生凋亡的细胞也可能出现磷脂酰丝氨酸外翻现象，从而误导实验结果。分批次消化能够精准控制消化程度，使每个批次的细胞都能在适宜的消化条件下被分离，最大程度地减少因消化不当导至的细胞损伤和凋亡误判。 3. 细胞操作注意事项 在整个样本制备过程中，必须高度重视机械力对细胞的潜在损伤。任何粗暴的操作，如剧烈吹打、快速离心、强力震荡等，都可能使细胞受到物理性损伤，从而诱导细胞凋亡，导至实验测得的凋亡百分率偏高。为了获取准确的实验结果，操作人员应秉持轻柔、精准的原则对待每一个细胞。在收集细胞时，尽量使用温和的离心速度和时间，避免细胞因离心力过大而受损；在重悬细胞时，采用轻柔的吹打方式，可使用带有适当孔径的移液头，以减少对细胞的剪切力；在转移细胞过程中，动作要轻缓，避免细胞受到剧烈碰撞。每一个细胞都承载着实验数据的准确性，都值得我们在操作过程中给予温柔的呵护，确保细胞在制备过程中保持其正常的生理状态，为后续的Annexin V凋亡检测提供真实、可靠的细胞样本基础。