低成本、开源、基于PCR的即时检测平台，减少开发IVD的资源浪费

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根据世界卫生组织的报告，传染病已成为全世界仅次于心血管疾病的第二大死亡原因。核酸检测技术已广泛应用于临床各种传染病的诊断，如新型冠状病毒（SARS-CoV-2）、乙型肝炎和人乳头瘤病毒（HPV）感染。即时核酸检测（POCT）的优点包括低成本、快速检测，实现了“样品进，结果出”的概念，而无需过多的人工操作。许多商业化的即时核酸检测设备被开发出来且各有特点，如GeneXpert®的模块化、FilmArray®的高通量和ID NOW®的可移植性。但目前的POCT平台都是封闭的，不同POCT设备的不兼容和重复开发造成了医疗资源的浪费。

近日，杂志scientific reports上发表了一篇题为“An open source, PCR based, point-of-care testing platform”的文章。本文提出了一种带有可拆卸试剂架的开放式旋转检测盒和相应的检测仪器，可在1小时内快速检测核酸。该平台具有稳定性好、检出限低、灵敏度高、特异度高等特点。这种可拆卸设计为研究人员和试剂公司提供了一个低成本和开放的POCT平台，使定制试剂的验证和POCT试剂盒的开发更快、更容易，希望能够促进POCT的进一步普及，减少因重复开发仪器而造成的资源浪费。

图片来源：scientific reports



主要内容

检测平台概述
本文提出了一种带有可拆卸试剂架的开放式旋转检测盒和相应的检测仪器。可拆卸的试剂架装有扩增试剂，而提取试剂和其他通用试剂封装在检测盒中。此即时检测系统基于PCR检测（见下图），主要步骤包括将样品添加到检测盒中，将试剂架置于检测盒中，将整个检测盒装入仪器中。核酸提取、核酸扩增及检测均在仪器中完成，无需人工操作。检测通常需要一个小时，结果显示在仪器屏幕上。

这种设计提供了一个开放和共享的POCT平台，使开发人员能够高效地测试试剂的性能，减少开发新仪器的时间和成本。检测盒的价格低于10美元，比同类产品更实惠，并大大扩大了其广泛应用的潜力。

仪器概述。图片来源：scientific reports



仪器及反应过程简述
核酸提取主要在检测盒下层进行，试剂在检测盒下层的分布如下图所示。约400µL样品加入样本室C室中，仪器会基于磁珠法自动进行核酸提取，并最终将核酸推入PCR芯片中进行后续检测。对于难以裂解的样品，如结核分枝杆菌，检测盒还设计了超声裂解室（E室）协助裂解。典型的核酸提取过程大约需要15分钟。PCR芯片插入PCR模块后会与加热板紧密接触，经过加热和冷却循环后完成PCR扩增。核酸扩增完成后，利用PCR模块中的荧光模块检测荧光信号，可以在单个检测盒中对六个不同的目标进行多重检测。

仪器上可直接定制反应过程中的各种参数，包括移液量、转移顺序、加热时间、磁性分离时间等。所有PCR参数，包括温度设置、加热时间、循环计数和循环持续时间都可以修改。该系统在成本和开放性方面具有优势。

反应过程简述。图片来源：scientific reports



系统性能验证
使用HPV16、HPV18、其他HPV类型、SARS-CoV-2、甲型流感和乙型流感来测试检测盒性能的稳定性。同一台仪器上使用10个检测盒对这些样品进行10次测试（图a）。每种样品10次试验的变异系数（CV）均在3%以下，证实了系统的稳定性。当HPV16、HPV18和其他HPV的阳性样本浓度为每毫升1000份拷贝时（图b），检测盒系统实现了100%的检测成功率。对于COVID-19，此系统检测限低至200拷贝/毫升。最后，不同检测盒仪器之间的精度测试结果也表明，仪器之间的Ct值偏差很小，CV值低于3%，证实仪器之间具有良好的精度（图d）。

系统性能验证。图片来源：scientific reports



临床检测准确性的验证
使用599份咽拭子样本来验证检测盒系统检测SARS-CoV-2和甲型和乙型流感病毒的准确性，结果显示（如下表），该系统对这三种靶标均表现出出色的检测准确性。在所有检测样本中均未出现假阴性，对三种靶标的灵敏度均为100%。SARS-CoV-2和乙型流感检测均无假阳性，特异性达到100%。甲型流感检测中观察到3例假阳性，其特异性为99.4%。

作者对497例宫颈脱落细胞样本进行了测试，使用了13 + 2检测试剂盒，不仅检测HPV16和HPV18，还检测另外13种HPV类型，适用于低成本、快速的HPV筛查。结果显示，未出现假阴性，三个靶标的灵敏度均为100%。出现一些假阳性，三个靶标的特异性都超过98%。6个靶点的ROC曲线AUC值均超过0.98，证实了检测盒系统的可靠性。

临床检测准确性的验证。图片来源：scientific reports



总结与讨论
本文介绍了一种带有可拆卸试剂架的开放式旋转检测盒及其相应的仪器，可在1小时内快速检测核酸。该平台具有稳定性好、检出限低、灵敏度高、特异度高等特点。与标准结果相比，对多种呼吸道病毒和HPV病毒的检测灵敏度达到100%，对所有靶点的特异性均在98%以上。所有受试者工作特征曲线AUC值均超过0.98。创新的可拆卸设计不仅为研究人员和试剂公司提供了一个低成本和开放的POCT平台，使定制试剂的验证和POCT试剂盒的开发更快、更容易，希望能够促进POCT的进一步普及，减少因重复开发仪器而造成的资源浪费。

该系统也面临着一些挑战，包括测试时间相对较长，目标数量相对较少通过优化核酸提取工艺和PCR工艺参数，缩短检测时间。还可以通过添加更多的荧光染料及其相应的滤光基团、根据熔融曲线区分核酸、应用荧光编码技术等方法来扩大靶标的数量。这些改进将显著提高系统的性能。通过与国际组织和政府机构的合作，该平台适合推广用于欠发达地区的传染病筛查。

来源：小桔灯网
作者：动力彩虹

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