557种物种、40种PAM类型！最全面的基因编辑脱靶预测工具来了！

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基因编辑技术如CRISPR系统在医疗和农业领域展现出巨大潜力，但一直以来，脱靶效应都是令研究人员头痛的问题。脱靶不仅降低编辑效率，还可能引发意外后果。
更复杂的是，由于每个个体的基因组中都存在独特的遗传变异（如SNP、插入缺失等），这些变异会导致脱靶位点在不同个体间存在差异。这就要求脱靶预测工具必须考虑到个体的遗传变异。
近日，《Nucleic Acids Research》在线发表了韩国釜山大学Jeongbin Park团队的最新研究成果：‘Variant-aware Cas-OFFinder: web-based in silico variant-aware potential off-target site identification for genome editing applications’，该论文介绍了一款名为"Variant-aware Cas-OFFinder"的新工具，在原版Cas-OFFinder的基础上实现了重大升级，为个体化基因编辑打开了新的大门。


新工具有哪些亮点？
1. 变异感知能力
最大的亮点是这款工具能够考虑个体遗传变异，在单倍型水平上识别潜在脱靶位点。也就是说，它能区分不同染色体拷贝上的潜在脱靶位点，提供更精准的预测。
2. 超广谱覆盖
与仅支持人类基因组或有限物种的其他工具不同，这款工具支持557个物种和40种PAM类型。相比之下，同类工具如SNP-CRISPR仅支持有限物种和NGG、NAG的PAM类型。
3. 高度可定制性
所有PAM类型和目标基因组都通过用户可编辑的YAML文件定义，使得工具具有高度模块性和可定制性，能适应各种特定物种的基因组编辑任务。
4. 易于使用的网页界面
与一些仅支持命令行的工具相比，Variant-aware Cas-OFFinder提供了用户友好的网页界面，无需登录即可使用，网址为：https://rgetoolkit.com/var-cas-offinder。
工具如何工作？
研究团队设计了一个完整的流程（图1）：

• 接收单样本VCF文件和参考基因组作为输入；
  
• 使用多种工具对VCF文件进行处理和标准化；
  
• 重建等位基因FASTA文件；
  
• 使用处理好的FASTA文件识别潜在脱靶位点。
  

图1

实际效果如何？
研究团队使用辣椒和人类基因组对工具进行了基准测试。
在辣椒基因组测试中，研究人员选择了针对CaPAD1和CaPUN1基因的6个sgRNA进行测试。结果显示（图2），与原版Cas-OFFinder和其他工具相比，新工具能发现更多潜在脱靶位点，且识别出了一些其他工具无法发现的独特位点。
以"TTGTGAAATCTAAGTGTAGNNN"这一gRNA序列为例，在第1号染色体上，原版Cas-OFFinder仅识别出36个潜在脱靶位点，而新工具在两个等位基因上分别识别出621个位点。这种差异在其他染色体和其他sgRNA序列上也有明显体现。



图2

在人类基因组测试中，研究人员发现新工具能够识别出参考基因组中未发现的潜在脱靶位点，比如在第10号染色体上的一个位点（Table 1）。



Table 1

与其他工具比较
研究团队将新工具与CRISPRitz进行了比较。虽然新工具的执行时间略长，但CRISPRitz不支持单倍型感知的脱靶预测。此外，由于CRISPRitz无法考虑小的插入缺失，有时会报告略多于实际的脱靶位点。
局限性与未来方向
目前，该工具仅考虑基因组数据中的小变异（SNP或小插入缺失），尚不考虑结构变异。此外，虽然在原理上支持多倍体基因组，但当前主要在二倍体基因组上进行了验证。
研究团队计划在未来拓展并验证该工具与多倍体基因组（倍性>2）的兼容性，这对于许多植物物种的研究尤为重要。
Variant-aware Cas-OFFinder作为首个基于Web的、考虑单倍型的变异感知脱靶预测工具，为基因编辑技术的精准应用提供了重要支持。它能找到其他可用工具无法发现的独特脱靶位点，有望提高基因编辑的精度，并在个性化人类治疗和农业应用中发挥重要作用。
这一工具的出现，无疑将推动基因编辑技术向更精准、更个性化的方向发展！
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