高效杂交瘤筛选：iQue高通量流式细胞仪简化抗体发现

检验之星

单克隆抗体是多种创新疗法的核心基础，包括抗体偶联药物（ADC）、双特异性抗体和CAR-T细胞疗法等。2024年4月，FDA批准了第100个单克隆抗体药物——葛兰素史克（GSK）的PD-1阻断剂dostarlimab，这一里程碑事件标志着单克隆抗体药物正式进入"百抗时代"。从药物作用机制来看，尽管已获批的单克隆抗体在抗原表位识别、抗体结构和作用形式上存在显著差异，但它们大多通过结合相同靶点或调控单一信号通路中的多个靶点发挥治疗作用。这种高度集中的靶点竞争格局为药物研发带来了新的挑战：研发人员需要在保证药物安全性的前提下，以更高的效率开发出具有更优作用机制、更佳药代动力学特性以及更先进给药系统的新一代单克隆抗体药物。
新一代抗体药物专注于更具挑战性的治疗靶点，例如G蛋白偶联受体（GPCR），需要能够进行大规模筛选的高通量方法，以及能够轻松分析大量复杂数据的自动化软件来助力。
赛多利斯的iQue高通量流式细胞仪为新一代抗体发现与开发提供了完整的解决方案。该仪器创新性地整合了高通量采样技术、流式细胞术和多孔板分析技术，显著提升了抗体筛选效率，仅需微量样品即可在20分钟内完成384孔板的检测。在抗体开发过程中，iQue高通量流式细胞仪配合ForeCyt软件特有的Plate Map、Profile Map和Panorama功能，能够快速生成可视化分析结果，为抗体筛选和优化提供关键数据支持。这种高效的技术组合不仅简化了抗体发现流程，还大幅加速了抗体开发进程，为新一代抗体药物的研发提供了强有力的技术支撑。


ImmunoPrecise抗体的发现三个主要阶段为：
1、稳定细胞系建立；
2、血清评价；
3、大规模杂交瘤克隆筛选。
赛多利斯的iQue高通量流式细胞仪在每一个阶段都最大程度地加速了简化了实验
1、细胞系生成——快速节约的高通量筛选，灵活自动化的数据分析及排序
为了开发稳定的细胞系，ImmunoPrecise采用含有编码靶抗原的慢病毒对细胞进行转导。尽管慢病毒介导的转导方法能够显著提高基因转导效率，但由于许多蛋白质表达存在困难，仍需进行大量的筛选工作。在选择性培养基中培养转导细胞约两周后，将其中一半细胞移入96孔板，经过洗涤后，加入荧光标记的特异性抗体并混匀。随后，利用iQue®和ForeCyt®自动化软件，在一小时内快速完成了四百多个克隆（分装于5块96孔板）的抗原表达水平分析（图1A），同时进行细胞计数，并根据细胞数量对表达量排名前25的克隆进行排序，监测细胞生长指标（图1B）。


2、血清评估——多步骤合一，同时检测靶抗原和对照抗原结合能力，并筛选交叉反应性
在开发新一代抗体的过程中，通常需要通过多种不同方式将抗原呈递给免疫系统，以确保获得具有所需特性的抗体。在ImmunoPrecise的研究中，采用了纯化蛋白、表达抗原的DNA质粒、表达抗原的细胞以及脂质包埋抗原四种方式，对36只BALB/c小鼠进行免疫接种，每种方式分别免疫9只小鼠。随后，对免疫前和免疫后的36只小鼠的血清进行8倍稀释，并对抗体滴度进行测试。在此过程中，对2500份稀释血清样本进行了重复检测，以确保结果的准确性和可靠性。
赛多利斯的iQue高通量流式细胞仪使用一种独特的编码方式来验证抗体特异性：用不同强度的荧光染料编码表达靶抗原、相关抗原或亲代细胞系的细胞，并混合到同一个孔中。将三种不同的分析组合成一组分析，大大加快了分析效率。随后通过荧光差异对各个细胞群进行分离。HeatMap显示了抗体与对照细胞、表达靶抗原的细胞和表达无关抗原的细胞结合的结果（图2）。


3、杂交瘤筛选——确保构象完整的天然活细胞检测模式，一天内完成近万个杂交瘤筛选分析
根据步骤二中的数据，我们选择了两只小鼠用于杂交瘤的生成。为了最大限度地识别抗体leads，我们在分析之前，将9600个杂交瘤置入25个384孔板中生长14天。随后，我们将杂交瘤克隆的上清液与用于抗体滴度测定的三个编码细胞系混合，用以测定抗体的结合和特异性。由于iQue高通量流式细胞仪仅需极微量的上清液，因此我们可以将多余的上清液用于重复测试或下游功能分析。这一策略不仅降低了成本，还加快了抗体发现的进程。整个筛选过程和数据分析可在一天内完成。三个细胞系的抗体结合情况如图3所示。


ImmunoPrecise Antibodies在抗体发现流程中的多个步骤使用iQue高通量流式细胞仪，以加快产生抗体leads的时间。iQue高通量流式细胞仪和集成的ForeCyt软件对其用户的价值在于快速、高通量的采样以及实时、多重性孔板数据分析。多重细胞分析将多个分析组合到一项研究中，简化并加快了抗体筛选工作流程。“微型化”的分析模式降低了成本，节省了宝贵的抗体上清液，使其可用于额外的验证性或功能性研究。

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