真核过表达目的蛋白WB检测不到如何解决？

HaHa

用PIRES2-EGFP载体将目的基因转染293t细胞，转染后细胞有绿色荧光，但是培养上清及细胞裂解产物进行WB及IEF验证均未看到目的条带（目标蛋白为5kd左右糖蛋白），酶切、测序鉴定没问题，转染试剂用的invigentech transfection reagent，转染效率有70~80%

原文地址：https://www.zhihu.com/question/430809461

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FLAG标签蛋白快速检测试剂盒
德泰生物FLAG标签蛋白快速检测试剂盒利用侧向层析免疫检测技术，可快速定性检测细胞培养上清、细胞/细菌裂解产物或纯化后的FLAG标签蛋白。检测时，仅需将试纸条加样区按箭头指示加入样品中，或吸取少量样品加至试纸条加样区，等待10分钟，即可读取检验结果。
产品优势

· 快速：仅需10分钟即可完成检测
· 准确：结果与其他抗体免疫检测相似
· 操作简便：细胞培养上清、细胞/细菌裂解产物样品无需稀释，无需其他仪器设备
· 重复性好：批内、批间检验结果、显色度一致
使用场景

1.判断FLAG标签融合蛋白是否表达
2.蛋白表达过程中优化蛋白表达诱导时间
3.蛋白纯化过程中检验各个洗脱组是否含有目标蛋白
检验原理

本品采用胶体金免疫层析法原理快速定性检测细胞培养上清、 裂解液或蛋白纯化后的 FLAG标签蛋白。


检测时，样本在毛细效应下层析。如被检样本中不含FLAG标签蛋白时，则结合垫上的金标抗FLAG标签抗体与固定在检测线处的FLAG标签蛋白结合形成“Au-抗FLAG标签抗体－FLAG标签蛋白”复合物，从而在检测线（T线）出现一条红色条带；如被检样本中含有FLAG标签蛋白时，则FLAG标签蛋白与金标抗FLAG标签抗体结合形成“Au-抗FLAG标签抗体－Flag标签蛋白”复合物，未反应的金标抗FLAG标签抗体会与检测线（T线）上的Flag标签蛋白反应，T线出现一条红色条带，随着被检样本中FLAG标签蛋白含量的增加，T线显色逐渐减弱，直至完全不显色。无论被检样本中是否存在Flag标签蛋白，金标鸡IgY都会向上层析至控制线（C），与羊抗鸡IgY反应出现一条红色条带。控制线（C）所呈现的红色条带是判断层析过程是否正常的标准。
检验方法

1. 取出试纸条，平衡至室温；
2. 可将试纸条按箭头指示插入样品中，或者吸取75 μL样品添加至试纸条加样区，加样时注意不要产生明显气泡，计时器记时，10 分钟判读结果。
检验结果判定

1.阴性结果：质控线C和检测线T都出现红色条带。
2.阳性结果：质控线C出现红色条带，检测线T不出现红色条带。
3.无效结果：质控线C不出现红色条带。


试剂盒使用常见问题

Q：使用FLAG标签蛋白快速检测盒样品检测的最佳浓度是多少？
A：≥1ug/mL。
Q：使用FLAG标签蛋白快速检测盒是否需要设立对照？
A：为了结果的准确性，须设立阴性对照和阳性对照（建议对照样品与待测样品为同基质）。
Q：不同样品检验后检测线T显色深浅不一，是什么原因？
A：样品中不含FLAG标签蛋白时，检测线T显色最深，随着样品中FLAG标签蛋白含量的增加，检测线T显色逐渐减弱，直至显色消失。
Q：是否可以使用FLAG标签蛋白快速检测盒样品进行定量检测？
A：本试剂仅对样品中的FLAG标签蛋白提供定性检测。
<hr/>更多产品

德泰生物标签蛋白快速检测试剂盒

产品名称	货号	规格
His标签蛋白快速检测试剂盒	DTT01	10 tests
FLAG标签蛋白快速检测试剂盒	DTT02	10 tests

德泰生物标签抗体

产品名称	货号	种属	规格
His标签抗体	DTH01	Mouse	100μg / 500μg / 1000μg
His标签抗体	DTH02	Rabbit	100μg / 500μg / 1000μg
GST标签抗体	DTG01	Mouse	100μg / 500μg / 1000μg
GST标签抗体	DTG02	Rabbit	100μg / 500μg / 1000μg
Flag标签抗体	DTF01	Mouse	100μg / 500μg / 1000μg
Flag标签抗体	DTF02	Rabbit	100μg / 500μg / 1000μg

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首语


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规避内源蛋白与免疫小鼠同源性高的问题，专注于兔源单克隆重组抗体的开发，抗原表位识别多样化，特异性和亲和力大大增强；直接获取抗体基因序列，后期生产便捷、稳定、可控。



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不太了解这个质粒具体情况和你是怎么插入目的基因的，但是首先，如果是空载体是否会表达GFP？如果会那就很好理解了，如果不会的话WB用的抗体是否针对你选用的目的蛋白的片段？能否用GFP抗体再试一次？
然后你是否做过RT-PCR或类似实验确认过mRNA表达情况？