重磅！Nature Nanotechnology：用于疾病筛查的新型多功能纳米探针

HaHa

Biomarkers是进行疾病筛查、预后和治疗监测的有效检测指标，其检测通常依赖于高灵敏度和高特异性的功能性纳米探针（例如标记抗体或功能肽）。理想的功能性纳米探针应具有较高的结合亲和力、较低的生产成本以及易于进行大规模生产和存储等优势，这对于流行性疾病的快速筛查尤为重要。目前虽然已有多种策略可以将生物分子（如抗体）精确地附着到材料上以提高探针的靶向亲和性，但仍存在偶联效率低、位点特异性差和靶点结合效率低下等问题，功能性探针要实现广泛的应用仍然极具挑战性。
来自澳大利亚昆士兰大学的研究团队开发了一种高性价比且制作简便的多功能纳米探针模型，可用于疾病快速筛查，该成果发表在Nature Nanotechnology上。此研究团队将探针命名为synthetic bionanofragments (SynBioNFs)。SynBioNFs是基于工程化酵母菌衍生的合成生物纳米片段，通过基因工程改造使其拥有多功能组分，包括内源性的特定目标结合剂（纳米抗体）和通用表面粘合剂（粘附肽），研究证明SynBioNFs可在包括表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)、荧光、电化学、比色侧向层析(colorimetric lateral flow assay, LFA)等多种检测平台捕获并检测SARS-CoV-2病毒(SCV2)，其灵敏度可与金标准方法RT-qPCR相媲美。该探针模型能实现生物标志物的高效检测，有望应用于大流行性疾病筛查。


一、SynBioNFs的结构特征及优势性能
SynBioNFs本质是基因工程改造的酵母菌超声破碎后的细胞壁碎片（纳米探针颗粒）。SynBioNFs模型为以酵母菌细胞壁蛋白Aga2p为骨架，分别在N端和C端连接多功能蛋白/肽成分，超声破碎后纯化得到同时拥有特异性结合位点和通用的表面结合剂的纳米探针Targeting binder-Aga2p (anchor protein)-Surface binder（图1）。
与市售的生物标志物检测抗体相比，SynBioNFs包含酵母细胞壁中丰富的多糖羟基（能增强功能蛋白的稳定性），在高温、低pH和强洗涤剂条件下具有更高的稳定性；同时得益于工程化的改造，SynBioNFs对目标蛋白也表现出更强的亲和能力。因此，不管是从制备难易程度还是稳定性、亲和性等层面评估，SynBioNFs都具有优良的生物标志物检测特性。
为验证SynBioNFs在SCV2检测中的功能，作者选用SCV2受体结合域(SCV2 receptor-binding-domain, SCV2 RBD)作为靶标结合剂，MatterTags11、SpyTags和 StrepTags3种常见的功能肽作为表面结合剂，并结合表面增强拉曼散射(SERS)、电化学(Electrochemical)、荧光、比色等方法对SynBioNFs的诊断能力进行评估，证明了SynBioNFs的精准靶向性和在不同检测平台的通用性。



图1. SynBioNFs设计技术路径

二、SynBioNFs的制备和表征
将W25-MatterTag（靶标结合剂）、Sb68-SpyTag（表面结合剂）分别连接在Aga2p（锚定蛋白）N端和C端制备重组质粒后导入酵母菌。经过培养的工程化酵母菌使用anti-myc-Dy650荧光抗体和SCV2 RBD–mNeonGreen进行标记，并利用流式细胞术对酵母细胞进行鉴定（图2），明确重组质粒在酵母菌中高表达。而后超声破壁处理酵母菌（对蛋白质活性没有不利影响），分离纯化获得SynBioNFs，使用纳米流式（NanoFCM）对其粒径分布进行检测（图2 e, f），约为70 nm。



图2. 流式对酵母菌蛋白表达图谱(a,b,d,e)、NanoFCM对SynBioNFs的粒径表征(c,f)

三、SynBioNFs捕获纳米探针
为了更好的为生物标志物提供捕获反应界面和提高探针的检测灵敏度，作者选用纳米金作为SynBioNFs探针的载体平台，将SynBioNFs固定在金微电极表面。作为捕获探针，SynBioNFs（修饰W25-MatterTag作为表面结合剂）仅需10 min就能与金表面完全结合，这与W25-MatterTag辅助的可溶性蛋白固定在材料表面一致。



图3. SynBioNFs（W25-MatterTag）在金表面的固定化

四、SynBioNFs检测纳米探针
SynBioNFs（修饰Sb68-SpyTag作为表面结合剂）可与SpyCatcher包被的金银合金纳米盒通过简单的孵育完成自动组装，偶联产生用于读取高度特异性和灵敏信号的检测纳米探针。为了验证SpyTag和SpyCatcher在探针结构中的关键作用，作者制备了不同的偶联物组合，与RBD-mNeonGreen反应后，通过NanoFCM检测荧光信号强度以评估SynBioNFs作为生物探针的优越性。结果显示，Bioconjugate 1（同时含有SpyTag和SpyCatcher的生物偶联物）的荧光强度远高于其他组，这一结果表明了SpyTag和SpyCatcher这个偶联结构在SynBioNFs和纳米盒连接过程中的必要性，使用SpyTag和SpyCatcher作为一种简单和模块化的生物偶联方法，为纳米探针生物功能化提供了一个潜在的有效策略。



图4. SpyTag和SpyCatcher在SynBioNFs与金-银合金纳米盒结合探针中的作用

此外，为了验证SynBioNFs与纳米金-银盒的组装速率，作者利用NanoFCM检测不同孵育时长制备的SynBioNFs（Sb68-SpyTag）金银合金纳米盒（包被SpyCatcher）生物偶联物，发现孵育1 min即可实现85.8%组装效率，孵育时间在10 min和30 min的组装效率对比无显著差异，即该偶联系统可在10 min内快速完成组装。



图5. NanoFCM对SynBioNFs与纳米金-银盒的不同时长组装效果检测

综上，SynBioNFs在捕获能力、荧光强度、组装速度等方面均展现了显著性的优势。紧接着作者使用SynBioNFs在SERS、荧光分析、比色法LFA等不同技术平台验证了其对SCV2病毒检测的特异性和浓度敏感性，结果确认了SynBioNFs与RBD对SCV2反应的高特异性和低浓度响应需求。SynBioNFs作为下一代纳米探针，与市场上的传统探针相比，具有低成本高效益且制造简单的优势，在疾病诊断方面拥有非常广阔的应用前景。
NanoFCM展望
NanoFCM覆盖传统流式200 nm以下的检测盲区，在生物纳米探针的设计和研发过程监测中具有显著的优势：单次检测即可获得纳米探针的粒径、浓度等物理参数，同时还可基于NanoFCM的超高荧光灵敏度，快速检测功能组分结合之后的荧光强度水平，进一步优化组分设计，提升探针的检出灵敏度。当然，NanoFCM还可基于荧光抗体或染料标记策略验证探针的组装效率、甚至是构建好的探针与待测病毒样品的结合效率等，助力纳米探针研发全流程，推进纳米探针在疾病诊断中的应用。

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