Western blot到底是个啥子（上篇）

检验之星

Western Blot又名Western Bloting、Western、蛋白质印迹法、免疫印迹试验，在实验室，可能是为了节省我们宝贵的科研时间，我们简称为WB，师兄师姐们代代相传，如果哪天谁在实验室大喊一句“我明天要做Western Blot！”。。。。大家一定会满脸的不可思议
说到WB，师兄师姐们习惯将其称之为“玄学”也就是说，WB结果变幻莫测，同样的条件，你可能第一次跑出来了，之后的几次就怎么都重复不出来结果，或者说两个孔的上样量、样品完全一样，条带却是一个东倒，一个西歪。。。。这些问题都是很常见的。其实，称其为“玄学”是因为大家还没有摸索到其中的真理，对于每一次失败都找不出原因，实际上，WB实验步骤非常繁琐，每一个步骤有有很多小细节，一步错则步步错，一次WB短则两天，长则三天，接下来的两篇文章我将为大家介绍一下里面的关键环节，希望可以帮助到大家！
1.由来
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－DNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法，而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。
2.基本原理
Western Blot 基本原理：首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液处理以封闭膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
3.应用
寻找目的蛋白是否在样品中
在不同样品中比较蛋白质表达的差异，来比较干预的效果
进行一些临床诊断，如梅毒，风疹病毒，新冠病毒的特异性抗原


如图所示，可以看出敲低P300后，P300的表达降低了，说明敲低成功
4.WB流程
4.1.蛋白提取
我个人前几次WB失败的原因都出现在此步骤，由于我是老板的开门大弟子，很多实验细节都没有人带我，靠自己摸索，而老板一般都会给你梳理框架，细节上的问题一般都不会说，可能大佬觉得这些细节不值得一提，可我偏偏就败在各种细节上
首先，蛋白的提取根据蛋白定位主要分为全蛋白、膜蛋白、和核蛋白，另外，根据样本来源，又可以分为组织的蛋白，细胞蛋白，来源种类定位不同，提取的方法上就会有一些细微的差别
目前蛋白提取一般使用的都是商品化的试剂盒，按照说明书操作即可，裂解液一般有RIPA和lysis buffer，里面一般都包含蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，和PMSF，PMSF是剧毒，使用的时候做好个人防护，个人更推荐RIPA，裂解能力要强一点。


以提取贴壁细胞的全蛋白为例，需要注意的有以下几点
（1）裂解前要把细胞培养皿放在冰上，注意全称必须在冰上进行，所用的PBS，EP管必须是预冷的！不然蛋白质真的会降解！
（2）要对细胞进行计数并观察细胞状态，如果细胞数目太少&状态不好，就没有提蛋白的必要了，
（3）控制好裂解液的加入量，不要太多也不要太少，太多稀释蛋白，太少裂解不充分
我一般T25或者6cm dish加100ul，六孔板每孔最多60ul
（4）我用的是细胞刮刀来收集细胞，也可以用胰酶消化，二者均有利弊，细胞刮可能会损害细胞，而胰酶也有裂解不充分的时候，看自己选择
（5）最近发现，培养皿 在冰上摇晃裂解的时候，皿的内部会有蒸汽形成，稀释裂解液，加入的裂解液100ul，吸出来可能就多了三分之一，所以大家在冰上摇晃的时候要做好密封处理，不要太剧烈哦
4.2.蛋白定量
目前来说，实验室用的较多的蛋白定量的方法一般为BCA法，主要包括以下几点：
（1）标准曲线的绘制
根据蛋白标准品的吸光度值绘制标准曲线，在excel里利用散点图显示出公式和R2，R2为0.999X的都可以用，如果R2不够合适，就舍弃不在趋势线上的点重新插入散点图算R2


上下两行分别是蛋白标准的浓度和吸光度值


根据公式，带入样品的吸光度值，也就是y，来算x，算出来的x为稀释后的样品浓度
（2）复孔
我们实验室一般是蛋白标准做2个复孔，样品做3个复孔
（3）蛋白稀释浓度
我们实验室一般都是稀释4倍的哦，具体看大家的传统做法
（4）孵育时间
37℃，半个小时，如果浓度低可以延长时间
（5）蛋白浓度v*c=m(ug)
跑WB我一般每孔归一20ug  v=m/c，由蛋白浓度可以算出样品上样的体积
4.3.蛋白变性
我一般加5x的loading buffer(蛋白:loading buffer=4：1），97℃煮5-10min（97℃是因为我们的加热器只能调到这里。。。。）


今天就介绍到这里啦，因为还要看文献 ，后面的重头戏我在下篇来介绍，有什么好的方法我还会继续分享的，希望大家实验顺利！



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