Western blot你可能遇到的问题及对应解决方案

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Western blot你可能遇到的问题及对应解决方案
1 总述
Western blot（WB）是一种重要的实验室技术，可以对蛋白质进行特异性鉴定和表征。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分离的蛋白质通过电泳转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，然后与特定抗体孵育，然后检测感兴趣的目的蛋白质[1]。总体上来说，WB的主要步骤包含：电泳分离 → 转膜 → 封闭 → 孵一抗 → 孵二抗 → 检测→数据分析与作图。



（图1 western blot基本流程图）

2 如何选择抗体（一抗）
2.1 基本要求
利用WB检测目的靶蛋白都有多种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围并选中合适的抗体，需要考虑如下因素：适用于IP级别（天然蛋白）的抗体不一定适用于WB（表位暴露）；适用于WB的不一定适用于IHC；适用于IHC-P（抗原修复）的不一定适用于IHC-Fr（不修复）；购买前，必须仔细阅读抗体说明书！
2.2 单/多克隆抗体
单克隆抗体和多克隆抗体都是我们实验中常用的抗体产品。他们在识别的抗原表位、生产和应用等方面有一些区别。
单克隆抗体（monoclonal antibody）来自单个b细胞亲本克隆，因此每个抗原只能识别单个表位。这些b细胞通过与杂交瘤细胞融合而永生，允许长期产生相同的单克隆抗体。生产中获得的杂交瘤细胞为持续且可再生产的单克隆抗体来源，一旦制备成功就可以持续生产性能一致的抗体，这有助于提升实验过程和实验结果的一致性和标准化水平。因为单克隆抗体只检测抗原上的一个表位，因此具有以下优点：
（1）切片和细胞染色产生的背景信号更少；（2）单克隆抗体特异性地检测单个表位，不易与其它蛋白质发生交叉反应；（3）由于具有高特异性，单克隆抗体非常适于用作实验中的一抗，其产生的背景染色信号通常显著低于多克隆抗体；（4）相较于多克隆抗体，单克隆抗体的同质性非常高；（5）在相同的实验条件下，单克隆抗体实验之间的结果重现性非常高。
​其缺点包括：（1）特异性过高，可能导致无法进行跨物种的检测；（2）与多克隆抗体相比，单克隆抗体更易受化学处理造成的抗原表位丢失的影响；（3）这可通过合并靶抗原相同的两种或多种单克隆抗体进行补偿（例如使用抗体组合试剂盒）。
多克隆抗体（Polyclonal antibodies）是一种异质混合抗体，来源于多个b细胞的免疫反应，每个b细胞识别同一抗原上的不同表位。多克隆抗体可以识别任一抗原上的多个表位，因此相对于单克隆抗体有以下优点：（1）由于靶蛋白上的多个表位能够结合不止一个抗体分子，多克隆抗体的亲和性更高，可放大低表达水平靶蛋白的信号，还有利于在免疫沉淀 (IP) 和染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验中获得更好的结果；（2）与单克隆抗体相比，多克隆抗体因为不依赖单一表位，因此其对微小抗原变化（例如多态性、糖基化异质性或者轻微变性）的包容性更强；（3）可识别与免疫原蛋白质具有高度同源性的蛋白质，还可用于筛查非免疫原物种的靶蛋白；（4）多克隆抗体针对多表位的特点通常可提升检测的稳定性。
​多克隆抗体也有一些缺点：（1）易产生批次间差异；（2）产生大量非特异性抗体，可能会在某些应用中产生背景信号；（3）可以识别多个抗原表位，可能会发生交叉反应；（3）不适用于检测抗原的特定结构域，因为抗血清通常会识别多个结构域。



（图2 单克隆抗体与多克隆抗体比较）

2.3 结合实际情况选择抗体
抗体的生产现在是一门比较成熟的技术，但是各个公司因为技术沉淀的缘故，以及物种和目的的差异性导致抗体的最终效果可能不一定都满足我们的时间需求，因此，我们在选择抗体的时候应该把握好以下几点：（1）选择可靠的抗体公司；（2）将需要研究的目的蛋白的氨基酸序列发给抗体公司，咨询其能否检测到我们的目的蛋白（因为每个公司制备抗体的信息是保密的）；（3）咨询使用过该抗体的同仁，购买抗体的信息；
3 WB实践过程中遇到的问题及解决方案
3.1 有marker无蛋白条带



（图3 无特意蛋白条带）

可能原因：如果 marker 正常，其他位置没有条带（1）抗体无特异性，即抗体不合适；（2）可能是一抗或二抗的种属弄错了，比如兔的加成鼠的。
解决办法：（1）靶蛋白完全无信号，但内参是正常的，大部分情况是一抗抗体失效或用错二抗种属；（2）靶蛋白和内参均无信号，则考虑是否发光液失效；（3）如果膜上没有 marker 则为转膜失败；（4）如果中间出现了细微条带，可能是蛋白上样量太少，或一抗浓度过低。出现这种情况的概率是非常小的，图3展示没有任何蛋白印迹信号，大概率是抗体加错了；如果中间出现微弱的条带，可能是蛋白上样量太少（因为有的蛋白表达本来就很少，对于这种情况可以增加蛋白上样量），或一抗浓度过低，也有可能是ECL 发光液失效。
3.2 背景过高



（图4 western blot背景过高）

可能原因：（1）封闭物用量/成分/时间不恰当；（2）一抗浓度过高，导致抗体非特异性结合；（3）洗膜时间次数不够；（4）一抗孵育温度过高；（5）其它不恰当因素。
解决办法：（1）配制封闭液所用的脱脂奶粉应选用无防腐剂实验专用脱脂奶粉，检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭；（2）降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数；（3）室温37度封闭1小时以上（一般2小时），4度封闭过夜，均在摇床上进行；（4）调整一抗的浓度（高背景很可能是抗体浓度过高），可以进行梯度预实验。
3.3 非特异条带



（图5 western blot非特异条带）

可能原因：（1）WB使用的一抗产生非特异性结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好；（2）提取的蛋白样品降解，蛋白酶将靶蛋白分解成若干个不同大小的蛋白，而这些不同大小的蛋白同样可被一抗识别。
解决办法：（1）建议更换一抗；（2）在蛋白提取的时候适当增加添加蛋白酶抑制剂，降低蛋白的降解。
3.4 印迹出现气泡



（图6 western blot出现气泡）

可能原因：（1）在转膜的时候SDS-PAGE与PVDF膜之间存在气泡；（2）可能在转膜过程出现烧膜情况，尤其是半干转操作不当导致烧膜，因为半干转的时候不在有冰存在的情况下进行操作；（3）制作转膜的“三明治”时气泡没有赶完全；（4）PVDF印迹膜活化不佳。
解决办法：（1）在转膜的时候务必将SDS-PAGE与PVDF膜之间存在的气泡完全消除；（2）严格根据半干转的要求，进行适当的调整；（3）制作“三明治”时候，滤纸务必浸泡充分，在“三明治”制作时候，务必赶压气泡；（4）PVDF膜激活时间一定要足够，且全面激活。
3.5 出现拖带



（图7 western blot出现拖带）

可能原因：（1）一抗浓度太高和孵育时间过长；（2）检测的靶蛋白浓度过高；
解决办法：（1）一般出现这种情况主要在大分子量蛋白检测实验过程中，因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的，因此可以调整一抗的浓度；（2）洗涤一抗和二抗的时候严格按照流程来做，建议 5min * 5次（当然也可以每次适当延长1-2分钟，或者加入足够的洗涤液体），不用担心多次洗涤将抗体和蛋白洗掉，因为抗原和抗体的免疫结合是洗不掉的；（3）降低一抗孵育时间和蛋白的上样浓度/总量。
3.6 印迹出现弯曲条带



（图8 western blot出现弯曲条带）

可能原因：（1）配制的SDS-PAGE胶体中存在气泡，或其它不溶性杂质，导致SDS-PAGE胶不均不平整。
解决办法：在配制SDS-PAGE时候，务必将配制试剂的容器洗涤干净；（2）如果多次出现这种情况，建议更换新的制胶试剂。
3.7 印迹出现哑铃状



（图9 哑铃状印迹条带）

可能原因：（1）哑铃状条带的出现大的可能性就是胶没有配置好，胶凝固后不均一；（2）蛋白样品中含有较多的杂质，离心收集蛋白时候未被离心到底部，和蛋白一起被收集，在电泳过程中杂质沉淀在蛋白印迹孔的中间，靶蛋白被挤到两边（可能较小）；（3）转膜“三明治”未紧贴在一起，转膜滤纸或海绵由于使用消耗，滤纸及海绵变薄，海绵弹性不足。
解决办法：（1）在配制SDS-PAGE时候，务必配置好，完好的SDS-PAGE在拔出梳子的时候，可见每个孔在一条线上，并无凹凸或此轮状；（2）提取蛋白的时候务必保证蛋白提取质量的纯度和完整性；（3）及时更换滤纸，或者在制作“三明治”的时候，保证“三明治”的是紧贴在一起的。
3.8 边缘条带弯曲



（图10 western blot边缘条带弯曲）

可能原因：（1）出现边缘条带弯曲的极大原因是因为SDS-PAGE电泳分离时候电流不均一或者玻璃有破损。
解决办法：（1）尝试更换电泳槽跑胶，或者使用完整的玻璃板制胶；（2）不适用最边上的两个孔。
3.9 弯曲印迹条带



（图11 western blot弯曲条带）

可能原因：（1）在转膜时候出现问题，分子量稍大的靶蛋白，转膜时间过长，转膜装置产热过多，无法维持转膜时的低温环境，造成条带扭曲。
解决办法：（1）建议进行常规的湿转，尽量不适用半干转，在转膜的时候控制温度尽量在4℃左右，不要产生过高的问题。
4 western blot其它常规问题及解决方案
4.1 蛋白提取
严格按照蛋白提取的protocol进行，明确靶蛋白是胞质内蛋白 or 膜蛋白，因为这些蛋白的提取可能方法不一致。尤其是在出现问题的时候，就更应该要注意这些问题，并寻找到合适的解决方案。
4.2 SDS-PAGE配制
在配制SDS-PAGE胶的时候，务必使用洁净的容器，保证SDS-PAGE中无杂质。SDS-PAGE配制时候要查看玻璃板子是否有缺损。如果多次检测均为正常，但是条带异常建议更换新的SDS-PAGE配制试剂。
4.3 SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE的电泳是分离蛋白的关键步骤，实验过程中有的跑出“内八型”或者“外八型”的条带也很常见，因此电泳的过程中务必保证电泳槽是正常的。此外电泳液也是非常关键的，不少实验室会回收电泳液，在出现问题的时候，务必更换新的电泳液，因为多次使用的电泳液可能存在电解质或高，最终导致蛋白印迹结果失败。
4.4 转膜
转膜也是容易出现问题的环节，在转膜过程中，如果是分子量较大的蛋白，可以考虑优化转移缓冲液，转移缓冲液中加入20%甲醇，甲醇可以降低蛋白的洗脱效率，增加蛋白和膜的结合能力；转移缓冲液中加入终浓度0.1% SDS；提高转移电压/电流，增加转移时间；选择优质的转移膜。“三明治”制备时候，滤纸的润湿，紧贴，气泡赶出等都应注意。
4.5 封闭
一抗或二抗只要结合到膜上，在显色液的加持理论上就会显色。为了避免非特异性的结合，应用封闭液孵育膜，使所有的空白位点都应该被封闭蛋白占据实现封闭的作用。因此在封闭的时候应该保证37℃ 1-2h或者4℃封闭过夜，这样就能降低最终的印迹背景。当然背景过高可能也与一抗浓度/蛋白上样量过高/显色液作用过度等有关，因此在操作的过程中应该严格按照对应的说明书进行操作或根据实践经验进行适当的调整。
4.6 一抗孵育
在进行一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定，因此抗体的说明书是要好好的看一下的。一般情况，再以1:100-1:1000来稀释抗体问题不会太大。但有的时候抗体稀释度不够，会产生非特异的结合，带来高背景，因此，在出现问非特异性结合，高背景，拖带的情况下，应当考虑抗体的浓度可能出了问题。
4.7 二抗孵育
很多时候可能在跑胶的过程中，我们会检测多个蛋白，但是这些蛋白的种属来源不一样，往往会出现用错二抗种属的情况，因此在进行多个蛋白检测时候，务必检查一抗和二抗种属的对应关系。
4.8 显色液
在使用显色液孵育PVDF膜的时候，不要作用过度一般情况下内参可能只需要不到1分钟即可完成。表达较高的蛋白1-3分钟即可完成，表达低的蛋白理论上也不应该超过5分钟。当然具体的问题可能还要结合实践和显色液的说明书进行相应的调整。
4.9 洗涤
在封闭/一抗孵育/二抗孵育完成后，进行一定的洗涤是非常重要的。尤其是一抗/二抗孵育完成后的洗涤非常的重要。一般情况下至少洗涤5 min * 3次，每次的洗涤应该使用足够的TBST或者其它相关的洗涤液，不用担心洗涤会将结合的抗体清除，因为这种免疫结合是很强的很难洗涤清除特异结合。但是也不能洗涤太久，尤其是一些表达量较低，转膜效果不好，蛋白分子量大的蛋白，可能很多人认为这种免疫结合很强大，在做着一个实验的同时进行另外的实验导致洗涤时间过久，最终检测不到目的信号。
4.10 其它问题
Western blot实验还是一个要求比较高，步骤比较繁琐，耗时较长的实验，因此在操作过程中难免不会出现这样或那样的问题。当问题出现的时候，可以针对具体的问题查找相应的解决方案，如果多次失败，可能就需要考虑更换参与Western blot实验步骤的各种样品和试剂以及仪器。
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参考
[1] Kim B. Western Blot Techniques. Methods Mol Biol. 2017;1606:133-139. doi: 10.1007/978-1-4939-6990-6_9. PMID: 28501998.
[2] https://zhuanlan.zhihu.com/p/522851012
[3] https://zhuanlan.zhihu.com/p/526529982

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